赵菁 白跃宏

《中国组织工程研究与临床康复》2009年第7期

上海交通大学附属第六人民医院康复科上海市200233

赵菁，女，1982年生，山东省东平县人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事下腰痛的临床康复研究。

通讯作者：白跃宏，博士，主任医师，上海交通大学附属第六人民医院康复科，上海市200233

摘要：

背景：

端粒的长度与细胞老化、永生化、癌变有密切的关系。

目的：

探讨端粒长度变化在腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征中的意义。

设计、时间及地点：

对比观察，实验于2007-07／2008-02在上海交通大学医学院医学基因组学国家实验室完成。

对象：

25份竖脊肌组织标本取自2007-05／09，年龄29～49岁，平均（34．7±12．6）岁，其中10份为正常人标本，15份为腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者标本，根据年龄正常标本分为30～37岁和38～45岁2个对照组；非正常标本分为29～34岁、35～43岁和44～49岁组，每组5例。

方法：

取各组标本提取DNA，采用SouthenBloWing杂交技术，测量各组标本竖脊肌组织骨骼肌细胞端粒长度。

主要观察指标：

患者竖脊肌组织与正常组织端粒酶长度。

结果：

腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者竖脊肌细胞平均端粒长度明显比正常人竖脊肌细胞平均端粒长度短。且有显著性差异（P＜0．05），44～49岁组较短，29～34岁组其次。

结论：

端粒的异常状态参与腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征的发生。在腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征病变的过程中，端粒长度明显变短，与年龄有关。

0引言

端粒是真核细胞染色体末端的一种富含鸟嘌呤的DNA-蛋白复合体，是维持染色体结构完整所需的。端粒的DNA由多种蛋白质成分组成。人体端粒DNA由6个核苷酸重复序列TTAGGG组成。端粒可保护染色体末端不被降解，防止染色体相互融合、重组，减数分裂时维持染色体正确的配对移动，并能防止DNA复制时末端序列的丢失，提高一些物种有丝分裂是染色体分离的准确性。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用。目前，检测端粒长度（mean length of telomere restriction fragment，TRF)的变化及端粒酶的活性己成为人们研究细胞癌变、衰老和死亡的重要指标之一。

作者采用Southen Blotting杂交技术对10例正常竖脊肌组织，15例腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者竖脊肌细胞端粒长度进行测量。以探讨其在腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者病变过程中骨骼肌细胞的变化，为临床研究该疾病的病理转归提供实验室依据。

1对象和方法

设计：对比观察。

时间及地点：实验于2007-07/2008-02在上海交通大学医学院医学基因组学国家实验室（BSL-3）完成。

对象：25份竖脊肌组织标本均取自2007-05/09，年龄29～49岁，平均(34．7±12．6)岁，其中正常人标本10份，15份为腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者标本，按年龄将正常标本分为30～37岁和38～45岁2个对照组；非正常标本分为29～34岁、35～43岁和44～49岁组，每组5例。根据国务院《医疗机构管理条例》规定，受试者均知情同意。

实验方法：

端粒长度检测方法：人的端粒重复序列是TTAGGG以CCCTAA或TTAGGG为探针，通过Southern杂交就可以测出端粒长度。实验采用TTAGGG为探针。

DNA抽提：将样本剪成小块，加入液氮中研磨成粉状，酚原仿法常规抽提基因组DNA。经AmershamGene Quant Pro核算蛋白定量仪测定，所选样品纯度介于1．7～1．8，浓度＞0．5 g/L。

Southern blotting：按Telo TAGGG Telomere Lenth Assaykit所提供实验流程进行。

①在各组样本DNA中加入等量HinfⅠ和RsaⅠ进行酶切。

②样品酶切后，8 g/L琼脂糖凝胶（含0．5 g/L EB)5 V/cm电泳样品DNA20 u和120μL Marke混合物Ⅰ0．5h。

③凝胶置于0．25mol/L HCl中脱嘌呤5～10min，变性液（0．5 mol/L NaOH，1．5 mol/L NaCl）变性30min；中和液（0．5mol/L Tris，3mol/L NaCl pH 7．5)中和20min。

④正电荷尼龙膜（0．45μm)，毛细管虹吸法转膜。20×SSC中进行转膜。时间6h，结束后，将膜在120℃下烘烤20min。

⑤DIG Easy Hyb液预杂交液42℃孵育1h，带有地高辛标记探针的DIG Easy Hyb杂交液42℃水浴振荡过夜。Anti-DIG-AP工作液的准备：为避免聚集的抗体导致背景升高，在配置前，先将抗体溶液在13000r/min下离心5 min。将Anti-DIG-AP用blocking solution，1x（Solution 11)稀释至终浓度75 U/L（1：10．000)。

⑥Anti-DIG-AP工作液洗膜。

⑦室温下碘化丙锭化学发光，X-ray曝光5～20min。

图像获取：用扫描仪将尼龙膜上的图像扫入磁盘，用图像分析系统进行图像分析，图像的吸光度值减去背景的吸光度值，对比标准Marker相对分子质量，然后用软件计算出图像的端粒DNA片断长度。

主要观察指标：患者竖脊肌组织与正常组织端粒酶长度测定结果。

设计、实施、评估者：第一作者设计试验并实施，通讯作者评估，经过培训。

统计学分析：由第一作者利用SPSS13．0软件微机处理分析数据。对正常组织和慢性骨筋膜间隔综合征组织数据作χ2检验、t检验分析。

计算端粒平均长度：按下列公式计算，L=∑（Ai×Li）/∑（Ai），杂交带i处吸光度(Ai)、杂交带i处吸光度（Ai）/i处DNA分子大小（Li）（∑Ai/Li），Ai是所测条带中对应于每一个Marker位置上的吸光度值，Li为对应的每一个Marker分子长度。

2结果

腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者竖脊肌组织与正常组织端粒酶长度见图1和表1。

从表1中数据看出，正常组平均端粒长度值8.29809～8.388441kb。腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征患者组平均端粒长度值7.099784～7.423502kb，显著缩短（P＜0.05），患者44～49岁组较短，29～34岁组其次。

其中以Li为11.28时，正常人和患者端粒DNA长度见图2；计算平均端粒长度见图3。

从图2和图3中可看到腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征组端粒长度明显缩短。

3讨论

在实验中，15例非正常竖脊肌组织肌细胞端粒长度均明显缩短。在非正常组中，以5组缩短比较明显，可能与病变程度和年龄有关。Melk等研究发现，端粒长度随年龄增加而变短。有学者研究发现Epithalon多肽具有提粒酶活性，延缓端粒变短作用。可见端粒的变短与端粒酶活性有密切关系。

单细胞真核生物中的端粒需要维持一定长度，而人类细胞在正常情况下是非永生的，其端粒与其他真核生物的特点也相同。端粒的长度与细胞老化、永生化、癌变有密切的关系，端粒酶的激活是端粒延长的重要原因。然而，通过反馈调节作用；将端粒维持在一定长度范围内，如果这种监控减弱或消失，细胞的生物特性将发生改变。在中细胞真核生物中，由于端粒酶的存在，使一些生物的端粒保持在一定的长度范围内，且不随生长条件和培养时间而改变。这都表明在端粒长度相对稳定的细胞中存在调节端粒长度的机制。对于正常的竖脊肌细胞端粒保持一定的长度，在腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛病变发展中，其端粒参与并且逐渐变短。结合试验可以发现，患者组端粒长度明显变短，44～49岁组比较短，29～34岁组其次。由此预见，骨骼肌细胞端粒变短可以作为作为腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛病变程度的指标。

端粒酶是一个RNA蛋白质复合物，RNA中含有指导DNA合成的模板序列，绝大多数正常体细胞不表达端粒酶活性，少数具有增殖潜能的细胞可以有低水平的端粒酶活性表达。骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平或立方形细胞，称为卫星细胞，被认为是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的肌源性干细胞。一般情况，这些细胞位于肌膜和基底膜之间，保持不分裂、静止状态。但是，当肌细胞受到损伤刺激时，卫星细胞即被激活、增生并表达成肌细胞标记物。后面这些细胞同原有的骨骼肌细胞相互融合，或是彼此融合，形成新的肌纤维细胞。腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征与其他部位的骨筋膜间隔综合征病理变化相似，若得不到及时治疗就会引起肌肉的变性、坏死及纤维化，在慢性骨筋膜间隔综合征动物实验模型中也能发现这一点。这是腰肌重复性损伤形成的重要病理原因之一。因此推测，在腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征中，骨骼肌受到损伤，在损伤部位出现组织的变性和炎症反应同时，肌卫星细胞也会出现。在肌肉发生损伤后24h内，卫星细胞已经出现，并且由于受到损伤刺激的影响，卫星细胞已经出现了细胞核增大、DNA合成增加、细胞质含量增多和细胞质密度升高的现象，说明卫星细胞已经被激活，并开始表现出分裂利增殖，究其原因会发现细胞端粒酶活性被激活、复制。在DNA复制过程中，由于聚合酶不能复制线性染色体的5’末端，每次细胞分裂时端粒DNA就会丢失50～200bp，引起端粒缩短。

在实验中，也发现腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛患者骨骼肌细胞的端粒长度7．099784～7．423502比较正常人端粒长度8．29809～8．388441kb明显缩短，并且具有显著性差异（P＜0．05)。当然端粒变短与端粒活性，年龄等也有密切关系，其过程是复杂的。这对研究腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛、认识其发病机制具有指导意义。同时也为临床诊断腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛提供实验室依据。腰骶部慢性骨筋膜间隔综合征所致慢性腰痛疾病的发生是一个复杂的过程，对其深入认识尚有待于进一步研究。