黄益民，赵辉，虞欣，钟伟，郭金良，孙素琴，李勇，公衍道，丁小兰

北京心肺血管疾病研究所血液流变学研究室，北京100029；

清华大学分析中心，北京100084；

清华大学生物科学与技术系，北京100084

摘要：

为探明自由基对红细胞膜脂质及蛋白分子损伤机理，本文通过电子自旋共振波谱仪（ESR）、激光拉曼波谱仪、圆二色波谱仪（CD）、显微付立叶变换红外波谱仪（MFT-IR）和表面电子能谱分析系统（ESCA）分别对体外自由基作用30分钟后，及作用后3小时红细胞膜整体结构、膜蛋白分子及脂质分子进行了分析。

结果发现，自由基作用后：

①红细胞膜中β-胡萝卜素构象由伸展变为卷曲，提示膜整体结构改变；

②膜蛋白分子二级结构变化，表现为α螺旋减少和β折叠增加；

③膜蛋白分子二硫键与巯基的比例增加（S-S/SH）、亚氨基（NH）和羰基含量改变，同时蛋白分子的氢键也被破坏（如NH、COH等基团的减少和VC、CO的增加）；

④膜脂分子磷氧双键（P=O）成分、羰基成分（C=O）、碳-碳双键（C=C）成分降低；说明自由基导致红细胞膜蛋白及脂质分子化学结构改变是造成膜分子构象及膜整体结构改变的根本原因。

3小时后无论是膜蛋白二级结构、二硫键与巯基比或膜脂分子P=O、C=O、C=C不仅没有恢复，反而有加重趋势。这说明了自由基损伤的部分不可逆性。

红细胞膜的流动性是红细胞顺利通过毛细血管完成与组织氧交换的重要保证。红细胞膜是由磷脂双层(外层主要为磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂与胆固醇形成互补作用，内层主要为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝胺酸与胆固醇反互补)、镶嵌蛋白及支撑于膜内侧的膜骨架蛋白构成。膜脂分子在脂双层结构中是不对称性分布的，同时它们还不停地进行着轴旋转、烃链的摆动及同层水平扩散等三种主要运动；而一些膜蛋白如一些受体、一些酶和一些通道等同样也不停的旋转和在脂双层中扩散；这种分子运动不仅是红细胞膜流动性的基础，同时也是这些分子发挥功能的必要条件。成熟红细胞外层的多不饱和酰磷脂烃链中的碳-碳双键的键角度使外层磷脂分子排列无序、疏松，分子间作用力较弱，流动性较大，而内层分子主要是饱和酰磷脂，有序性强，流动性较小。膜蛋白(骨架蛋白、受体、酶、抗原等)的二级结构中的α螺旋伸入到膜脂双层中，其螺旋外侧的疏水基团与脂双层疏水区的烃链形成疏水键，而二级结构中的β折叠多是铺于膜表面与磷脂形成疏水和静力作用，稳定及调节膜脂双层的不对称分布及流动性。膜脂分子及蛋白分子的流动性受着分子结构及相互作用关系的影响并终会影响整体膜的流动性。膜骨架是由多种蛋白相互连结而形成的网状结构，其蛋白成分不具有独立的及随机的运动；除支撑作用外，通过其部分蛋白嵌入膜脂双层而达到稳定及调节膜流动性的作用。膜骨架是红细胞膜弹性的主要决定因素。同样某些因素引起其分子结构改变终将会影响整个细胞的弹性。

自由基是含有不配对电子的高活性物质，它通过电子传递而与其它分子发生氧化-还原反应。自由基是自然存在的并是许多生理过程所需的，但当其产生过量或出现在不适当的细胞部位将通过过氧化反应而导致分子的结构及功能的破坏后面造成细胞、组织的病理改变。前期的研究已证明自由基特别是以氧为中心的自由基通过脂质过氧化而引起膜脂分子结构的改变，表现为烃链碳-碳双键的减少和游离脂肪酸的释放，此外自由基对蛋白分子的攻击可造成蛋白分子结构及功能的改变。这些分子结构的改变将影响其流动性。A．M，Phelar报导了在脑缺血/再灌注期间脑毛细血管内皮细胞膜脂质区流动性明显降低，认为与此期间产生的自由基损伤有关。红细胞由于有一个高氧含量并与氧反复混合，膜含有大量的高活性碳-碳双键的多不饱和脂肪酸，血红蛋白可提供催化产生损伤性自由基的铁离子而对过氧化损伤尤其敏感。我们前期的研究发现，人红细胞于体外与Fenton自由基体系作用30分钟后，不仅引起细胞膜剪切弹性模量(the shear elasticmodulus of membrane)明显增加，同时还引起膜脂质及蛋白分子流动性明显下降，3小时后，只有脂质分子的流动性回复正常，而蛋白分子流动性及膜的弹性模量只是部分回复。为探讨自由基引起的红细胞膜脂质及蛋白分子结构变化特征与这些分子流动性改变间的关系，本文利用电子自旋共振、激光拉曼、显微付立叶变换红外、圆二色及电子能谱化学分析系统等技术对体外自由基作用前后红细胞膜脂质及蛋白分子构象及化学结构的改变进行了分析研究。

1材料及方法

1．1自由基体系：

按照下列方法配制高、低浓度的Haber Weiss(Fenton)羟自由基体系。高浓度按1：1：1的容积比将3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和2．7％的NaCl混合制成等渗、pH7．0的羟自由基体系；低浓度按0．5：1：1．5的容积比将3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和1．8％的NaCl混合制成等渗中H7．0的羟自由基体系。分别在以上体系配制后的即刻、十分钟、三十分钟和一小时用自旋捕捉剂DMPO(5，5-DIMETHYL-1-PYROLINEN-OXIDE)捕捉自由基，并于室温条件下用电子自旋共振波谱仪(ESR Bruker ER-200D)在微波功率SP=10mW(13db)、调制幅度MA=5G、放大增益GN=5×104、中心磁场CF=3470G、扫场宽度SW=200G的条件下测自由基水平，证明配制后即刻已产生大量自由基且在一小时内被捕捉的自由基信号强度无明显改变。

1．2自由基对人红细胞的损伤及恢复：

十名健康成人红细胞(男女各五名)经等渗磷酸缓冲液(PBS)清洗两遍后分别与以上两自由基体系在室温条件下作用30分钟。作用后的红细胞经PBS清洗两遍后部分再于室温条件下于PBS中静置3小时。

1．3红细胞血影的制备：

自由基作用前、作用30分钟和静置3小时的红细胞用低渗Tris缓冲液(10mmol/LpH7．4)破膜40分钟，高速离心(25，000转/分，4℃)40分钟，去上清，用低渗Tris在上述离心条件下反复清洗沉淀物数遍，直至变为乳白色；再用0．9％NaCl液于50，000转/分、4℃、60分钟的条件下清洗沉淀物，去上清后获得红细胞血影。

1．4红细胞膜结构及分子构象的测定：

1．4．1用激光拉曼波谱分析仪(LRSSPEX-1403)在室温、功率500mW、波数范围950～1750cm-1、激发波长518．5nm的条件下，测定红细胞血影中β-胡萝卜素特征谱波数1528 cm-1/1446 cm-1的改变，观察膜中β-胡萝卜素的构象变化从而反映整体细胞膜结构的改变。

1．4．2将待测红细胞100μl再悬浮于PBS中，加入10-3mol/L的3-MCP3-(3-MALEIMIDOPROPYL-CARBAMOYL)-PROXYL 8μl充分混匀，室温静置2小时，标记膜蛋白巯基(-SH)。2小时后离心去上清，于室温条件下用ESR测定标记物的谱强及(测定条件SW=50G，SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104分子相对旋转时间，反映膜蛋白分子的宏观构象改变及分子运动性(图1)。

1．4．3将待测红细胞血影均匀涂抹于CaF2载样片上，在室温条件下用显微付立叶变换红外光谱分析仪(MFT-IRPE2000)测定和记录血影蛋白酰胺Ⅰ谱带1600～1700cm（-1）的红外光谱，光谱采集100次，对去卷积谱以高斯曲线拟合，蛋白二级结构中的α螺旋、β折叠及卷曲等各组分的含量根据组分谱带的相对峰面积计算获得。同时将以上待测血影10μl悬浮于1ml的PBS中并加入样品池中，在室温、扫描速度50nm/min、波长扩展10nm/cm、采集8次、采样间隔10ms、间隔时间1min、波长范围250～190nm的条件下用圆二色光谱分析仪(CD J-500C)测定并记录血影圆二色光谱通过曲线拟合分析血影蛋白二级结构各成分的改变。

1．5红细胞膜分子化学结构的测定：

1．5．1用(MFT-IRPE2000)测定和记录血影900～3700 cm-1范围的谱带，方法同1．4．3；计算3012cm-1、1234cm-1、1067cm-1峰面积比，分析膜脂分子疏水区碳-碳双键(-C=C-)、亲水区磷-氧双键(-P=O)、膜界面区羰基(C=O)等基团含量的变化。

1．5．2将待测红细胞血影均匀涂抹于盖玻片上，真空干燥后用电子能谱化学分析系统：(ESCA PE-PHl5300)在角分辨率45°、真空度10-10托、分辨率0．8eV、灵敏度8×104CPS、过能35．75eV、功率250W的条件下测定并记录膜中含硫基团(S-S、SOx、SH)、含碳基团(C=O、C-OH)、含氮基团(NH、NOx、NQ)的电子光谱，通过曲线拟合分析以上各化学基团的含量及比例变化和膜中分子化学结构的改变。

1．6数据分析：

用T-检验对自由基作用后的各实验参数与实验前有关参数进行医学统计学比较，设定P＜0．05时具有显著性差异，各参数以均值±标准差(X±SD)表示。根据公式{(改变指标-对照指标)/对照指标}×100％=变化率(±％)计算改变幅度，+代表增加，-代表降低。

2结果

激光拉曼分析结果显示，高浓度自由基作用后红细胞血影的1528cm-1/1446cm-1谱峰比与作用前相比尽管没有明显统计学差异，但平均降低幅度远大于低浓度自由基体系(约-40％比-21．6％)。由于1528cm-1/1446cm-1谱峰比的升高或降低反映β-胡萝卜素伸展构象或卷曲构象的比例变化，此处1528cm-1/1446cm-1谱峰比的降低则说明了高浓度自由基作用30分钟后，引起红细胞膜中β-胡萝卜素卷曲构象成分增加，提示膜分子间隙增大，膜整体结构改变(表1)。

无论高浓度或低浓度自由基体系作用30分钟后，ESR测定红细胞膜蛋白分子标记物的相对旋转时间均大幅度延长(表2)，但低浓度自由基作用后的变化较轻。由于膜蛋白分子运动速度较慢，因此此处被延长的相对旋转时间除说明膜蛋白分子运动性的降低外，还提示了标记物周围环境对其分子运动性的限制增加即蛋白构象(结构)改变。有意义的是在分子旋转时间延长的同时ESR测定到的标记物信号强度则成倍增加(表2)：由于标记物特异性结合于巯基(SH)，因此不难理解在自由基作用后，红细胞膜暴露的SH可结合位点增加，这是膜蛋白构象改变的重要证据。以上改变在3小时后只获得了小部分回复，但仍明显高于对照值，说明自由基引起膜蛋白结构改变几乎是不可逆的。

CD测定的结果显示，两个浓度的自由基的作用都使红细胞血影膜蛋白的二级结构中α螺旋成分比例减少(减幅分别为-15．8％和-13．7％)，而β折叠及卷曲成分比例相应增加；3小时后上述改变少回复(表3)；说明自由基导致了红细胞膜蛋白结构发生重构，这一结果进一步证实前面由ESR测定的自由基引起膜蛋白结构(构象)改变的发现。MPT-IR的测定结果与CD测定结果相吻合(表3)。

表4所示为ESCA测定红细胞膜血影的含硫成分含氮成分、含碳成分的改变情况：高浓度的自由基作用后膜上巯基在总含硫基团中的比例有所减少(减幅约-7．7％)，而S-S和SOx等基团的比例增加(增幅分别为约+3．3％和+6％)，3小时后SH进一步减少、S-S进一步增加、SOx则基本回复到对照水平。在含氮基团的变化中，亚氨基(NH)在自由基作用后有所降低(降幅为-6％)，氮=氧基(NOx)和NCx基团相应增加，(平均增幅为+7．7％和+2％)；3小时后NH基团比例基本回复，NCx只部分回复(仍高出对照+1．5％)，而NOx基团则低于对照。含碳基团中，在自由基作用后，COH基团比例减少，C=O基团比例增加；3小时后COH继续降低而CO基本回复。上述结果提示：自由基造成了红细胞膜蛋白分子结构的改变，其中巯基被氧化而形成双硫键和氧化硫基团，亚氨基被氧化成氧-氮基或氮-碳基结构，碳羟基被氧化又羰基。由于SH、S-S主要存在于膜蛋白中，是蛋白重要官能团及维持蛋白结构(构象)的重要化学键，本文中的变化则说明了自由基作用后膜蛋白发生结构上的重构。NH基团和COH基团又是构成维持蛋白正常二级结构的氢键中的重要官能团，他们的减少同样提示了自由基对膜蛋白氢键的破坏。

除ESR测定的膜脂质区分子相对旋转时间在自由基作用后延长、并于3小时后完全回复外，MFT-IR测定结果显示，两种浓度的自由基作用后红细胞膜脂的磷氧双键(P=O)、羰基(C=O)和碳-碳双键基团(C=C)都有所减少。由于含磷基团多位于膜磷脂的亲水端即膜表面侧，羰基位于磷脂分子的膜亲-疏水界面区、碳-碳双键则是膜磷脂分子疏水端—多不饱和脂肪烃链的主要成分，位于细胞膜的中间部分，因此上述改变提示本研究中自由基对膜表面和膜内部同时造成了损伤，推测自由基使膜磷脂的不饱和键部分转变为饱和键及羰基，这些分子结构的改变是膜脂分子旋转时间延长的主要原因。3小时后高浓度自由基作用的红细胞胺P=O、C=O继续减少和C=C无回复，而低浓度自由基作用的红细胞膜的P=O、C=C成分则有一定程度的回复(表5)，但在本研究所测的变化中总的表现出自由基浓度与各变化间有一定的量效关系，即随自由基浓度增加改变加重。

3讨论

本研究中对红细胞血影中β-胡萝卜素的构象测定表明了自由基作用后，造成了膜整体结构的改变。红外测定结果则进一步证实此时C=C减少。我们认为这是由于自由基使部分膜磷脂疏水区烃链的不饱和键形成饱和键以及脂质自由基之间的加成反应而使脂环内过氧化物形成所致，更重要的是我们同时发现了自由基作用后P=O和C=O基团的减少，说明自由基不仅攻击膜内部的不饱和烃链，同时还损伤膜磷脂分子亲水端头部的磷酸基或磷酸胆碱基及脂分子界面区的甘油骨架，这将导致膜脂分子极性的改变，提示脂质过氧化同时发生于膜表面及膜内部。以上变化终将引起膜脂分子构象、排列更加有序，相互作用增强及流动性降低等特性，进而影响膜的整体结构及功能。

在自由基作用后膜脂分子改变的同时我们还发现了膜蛋白分子结构的改变是以α螺旋成分减少，β折叠和无规卷曲成分增加为主要特征。这些变化将使插入膜脂双层中的蛋白α螺旋结构减少，膜蛋白与膜脂分子相互作用及束缚力减弱，蛋白维持膜脂分布不对称性和限制脂分子运动的作用降低，这将有利于发生过氧化反应的膜脂分子重新排列与分布而造成膜正常结构改变。根据ESR的测定结果，我们认为由于自由基损伤后膜蛋白标记位点增加但同时标记分子的运动又受限，说明膜蛋白分子本身构象的变化是以分子在膜表面部分的楔状缺损为主。在我们的预实验中发现体外纯蛋白与自由基作用30分钟后也引起其结构与红细胞膜蛋白结构改变相似的结果，即出现了蛋白构象的变化。进一步分析发现自由基作用后使纯纤维蛋白原的NH、CO等基团减少，而NCx、NOx及COH等基团增加，推测在自由基的作用下肽键一侧N上的氢转移到另一侧的CO上而形成COH从而使N氧化成NOx或肽键双键比例增加，由此蛋白分子中于CO和NH之间的氢键被部分破坏，进而造成蛋白分子二级结构(α螺旋、β折叠和无规卷曲)发生重构(式3)。

(式3)自由基引起氢键破坏后肽键改变的两种可能形式。

ESCA对红细胞血影膜的分析结果表明，自由基作用后SH减少、S-S和SOx等基团增加。由于巯基(SH)绝大部分为膜蛋白的特异性基团，易被氧化而失去氢原子，因此前述含硫基团的变化证明自由基造成了膜蛋白巯基氧化后二硫键和氧化硫基团的形成，这可直接造成膜蛋白结构(构象)的重构，膜蛋白自身功能及与膜脂分子之间的相互作用被打乱。与纤维蛋白原的改变相同的是，自由基作用后NH减少，NCx和NOx等基团增加；但不同的是此时CO增加而COH降低，这可能有两种解释：

①因为H2O2和OH很易穿过细胞膜，因此在它们过膜破坏膜蛋白氢键的同时，将NH基团上的部分氢原子抽取，并不发生NH基团上的氢往羰基氧上转移因而COH降低；

②膜脂不饱和键被自由基氧化使CO基增加。除上述二硫键形成外，此处氢键的破坏是本文膜蛋白二级结构(α螺旋、β折叠和无规卷曲)改变的主要原因之一。因此自由基损害膜蛋白结构的机理是自由基通过氧化巯基而形成二硫键，同时造成氢键破坏、肽键双键成分增加，终会导致膜蛋白结构、构象的改变(发生结构重构)。蛋白一旦发生重构后，很难再回复到正常结构，这可从本文中对3小时后血影蛋白分析的结果获得证实。由于红细胞没有合成蛋白而修复或替换被自由基损伤的膜蛋白的能力，因此自由基造成的本文中膜蛋白的损伤是不可逆的。

有意义的是在本文中：

①自由基损伤程度表现出了与自由基浓度有一定的量效关系；

②自由基引起的膜脂分子部分结构上的改变(如头部的P=O、C=O和CO等基团的改变)在3小时后的回复程度也与自由基浓度有关，提示自由基引起的红细胞膜脂质过氧化损伤的可逆性取决于损伤程度。

本文中的结果可明确地阐述我们前期有关自由基对红细胞膜分子流动性影响的机理：即自由基引起红细胞膜蛋白分子及脂质分子化学结构及构象的改变，从而造成这些分子间正常排列、相互作用的破坏，终使这些分子的流动性乃至整个红细胞膜的流变性降低；脂质过氧化损伤的部分回复可能是自由基损伤后3小时膜脂分子流动性回复正常的主要原因，但因膜蛋白损伤的不可逆性，3小时后整个红细胞膜的流变性、弹性模量(主要由膜骨架所决定)的改变只有部分回复。

4结论

本文利用生物物理的手段对自由基损伤后的红细胞膜蛋白分子和脂质分子的构象、化学键的特征性改变进行了分析，证明：

①自由基可损伤膜的完整性；

②自由基可通过氧化蛋白SH(巯基)形成S-S(二硫键)SOx(氧化硫)等基团，引起氢转移而破坏氢键，改变肽键结构，使蛋白发生结构重构；

③自由基不仅造成脂疏水烃链中不饱和键的减少，同时还攻击其亲水头部及界面区而引起膜磷脂分子极性、构象和有序性的变化；

④以上膜蛋白分子的变化几乎是不可逆的，而膜脂分子改变的可逆性与自由基损伤程度相关。