季永喻田
《国外医学.麻醉学与复苏分册》2004年06期
【作者单位】：遵义医学院麻醉学系
【摘要】：
线粒体DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是仅有的存在细胞核以外的遗传物质。自由基是造成mtDNA损伤的主要原因，以线粒体DNA点突变和缺失突变多见。mtDNA损伤可以导致线粒体氧化磷酸化功能障碍、细胞凋亡和死亡，引起对能量需求较高的中枢神经系统、肌肉等组织出现功能障碍甚至疾病。
线粒体DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是惟一存在细胞核以外的遗传物质，长度为16569bp，编码区共37个基因，编码22个tRNA基因，2个rRNA基因，13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白质基因，均为线粒体蛋白质合成所必需。在核基因调控下控制氧化磷酸化和ATP的合成及自我更新，维持线粒体基本功能。研究表明线粒体DNA损伤主要是由自由基造成的，核酸分子损伤后一般不降解而被直接修复，未被修复的损伤DNA片段可积累下来，造成进一步更大的损害，从而导致器官功能障碍。大量研究发现mtDNA氧化损伤与肿瘤、线粒体肌病、神经变性疾病和衰老密切相关。本文就这一氧化损伤发生、发展及防御机制的研究情况综述如下。
人体内自由基的90％来源于线粒体，而mtDNA直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，缺乏组蛋白及其他结合蛋白的保护，缺乏完善的损伤修复系统，致使氧化损伤成为mtDNA突变的主要原因，所以mtDNA比核DNA突变率高5～17倍。
1自由基的产生
自由基(free radical)是具有一个不配对电子的原子和原子团的总称。引起人体内氧自由基产生的原因很多。一方面，由紫外线和射线的照射、臭氧、大量体育运动、药物、酒精、吸烟等外来因素引发的自由基称为“外源性自由基”；另一方面，在新陈代谢过程中由人体内生化反应所产生的自由基称为“内源性自由基”。本文重点讨论内源性自由基产生的机制。
1．1自由基产生的线粒体机制
1971年Loschen年先发现线粒体呼吸链能产生氧自由基，研究表明人体90％的自由基是由线粒体产生的。生理状况下，有1％～2％的氧接受一个电子生成O2，或再接受一个电子生成H2O2。线粒体呼吸链可能通过“渗漏机制”产生氧自由基，复合物Ⅰ、Ⅲ是电子漏(electronleak)产生的主要部位，“漏出”的电子直接和氧结合形成超氧自由基。
1．2黄嘌呤氧化酶途径
缺血、休克等病理条件下黄嘌呤脱氢酶(xanthinedehydrogenase，XD)大量转变为黄嘌呤氧化酶(xanthine ocidase，XO)。降解ATP依次为ADP、AMP和次黄嘌呤，再转变为尿酸，反应中组织内O2-、OH·等氧自由基大量增加。
1．3花生四烯酸(AA)途径
缺血再灌注时，由于细胞内Ca2+超载，激活了钙依赖的磷脂酶，引发花生四烯酸(AA)代谢。通过环氧合酶和脂氧合酶的作用产生大量的OH·和H2O2。
1．4 NO合成酶(NOS)途径
NO是活性氮的前体，在血管内皮细胞、血小板、巨噬细胞和神经细胞等许多细胞中，由NO合成酶催化合成。过量的NO与氧迅速反应生成NO-、NO2、NO3-等。这些是强效氧化剂，能自由弥散通过胞膜，抑制细胞线粒体呼吸，减少ATP生成，引起组织损害。
另外炎症反应引起的中性粒细胞激活，杀灭病原微生物同时可形成大量氧自由基；各种应激反应导致儿茶酚胺增加，产生具有细胞毒性的氧自由基。
2自由基引起mtDNA损伤的实质
自由基对DNA、蛋白质、脂质、糖类等生物分子发生攻击的过程中，主要发生氢抽提反应、电子转移反应、加成反应、终止反应及歧化反应等5种基本的自由基反应。
2．1羟自由基
攻击碱基时，主要是·OH加成于富含电子的DNA双链，尤其在嘌呤N-7-C-8位点和嘧啶5、6-位点上；攻击糖基时，脱氧核糖链上一核糖被提取氢，导致链断裂，碱基逸失。这些碱基、糖基的改变可导致mtDNA点突变、缺失和插入突变，其中以片段缺失多见。
2．2氮氧自由基ONOO-
氮氧自由基可与H2O2形成1-O2，使DNA脱氨基生成黄嘌呤、次黄嘌呤，形成A-T、G-C的碱基突变，还可以增强线粒体氧化应激，及细胞对过氧化物介导损伤的敏感性。
2．3单线态氧
Cl-与H2O2反应生成OCl-，再与H2O2生成单线态氧，氧化DNA的鸟嘌呤。
2．4脂性自由基
据推测脂质过氧化过程中产生的LO·LOO·等自由基可以发挥与羟自由基相似的DNA攻击作用。
在生理情况下由于细胞内存有超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glrtathione peroxidase，GSH-PX)等抗氧化酶类可以及时清除自由基，保护机体。在病理条件下，由于活性氧产生的过多或抗氧化酶类活性下降，则可引发以上所述链式过氧化反应损伤线粒体DNA，进而导致各种线粒体DNA的损伤突变。
3线粒体DNA损伤的生物学标记
自由基在攻击线粒体DNA的生化反应中，常常在线粒体DNA双环结构中留下损伤的痕迹即损伤的生物学标记。在对线粒体DNA损伤研究中，寻找氧化损伤的生物标志物非常重要，例如反映mtDNA链断裂、8羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)的测定；反映DNA修复与代谢酶多态性指标谷胱甘肽硫转移酶(GSTS)及乙酰化酶(NATS)等的测定；近期研究表明，5羟甲基尿嘧啶也可以作为人类氧化应激的生物标志物。目前8-OH dG是更常用可靠的mtDNA损伤的生物标志物。
4线粒体DNA损伤的修复机制
过去多数学者认为mtDNA缺乏修复机制。近年来研究发现线粒体还是具有一定的DNA氧化损伤修复能力，但是这种机制并不完善。修复效率不如核DNA。
总之，线粒体中虽然存在某些DNA修复酶以防止突变发生，但缺乏校正阅读功能且清除突变碱基的能力较低，结果使突变率增高，大约是核基因突变的10～17倍。
5线粒体DNA损伤的种类
线粒体DNA病理损伤导致的mtDNA突变主要分为以下3类：在编码序列或tRNA、rRNA基因中发生点突变；mtDNA大段缺失，即丢失了一个以上的基因，如编码序列、tRNA序列的缺失；线粒体DNA丢失。
5．1线粒体DNA点突变
5．1．1编码蛋白基因的点突变是一种酶的生物缺陷
Leber氏遗传性视神经病是mtDNA11778位点的G-A突变，使ND4亚单位的精氨酸转变成为组氨酸，导致复合体Ⅰ功能减退。
5．1．2 tRNA的点突变
常见位于线粒体的tRNA-Leu（UUR）基因上3243位点的A突变成G，该突变可阻碍mtDNA编码的蛋白合成，并可严重导致rRNA转录终止，常见于线粒体神经肌肉性疾病，如线粒体肌病、线粒体性脑病、乳酸中毒、中风样发作综合征(MELAS)。
5．1．3线粒体核糖体RNA基因的突变
线粒体rRNA基因的12 SrRNA基因上第1555位A到G的突变，影响蛋白质的翻译，导致了母系遗传的氨基甙类诱导的耳聋和家族性耳聋。
5．2缺失突变
缺失突变不仅见于线粒体疾病，还可见于正常衰老组织。由于mtDNA特殊的结构特点，缺失可影响细胞的能量代谢。据病理分类主要有2类缺失。
5．2．1单个缺失
缺失的分子数量常占总mtDNA的20％～80％，常见于慢性进行性外眼肌麻痹(COEP)，Kearns Sayre综合征(KSS)及Pearson’s综合征。
5．2．2多重缺失
常见于组织的正常衰老过程，如骨骼肌、心肌及脑。通常有以下2种：
①mtDNA4977缺失是正常衰老组织中积累常见的缺失，缺失位点为8483bp～13459bp，位于编码ATPase8和ND5基因之间。在神经和肌肉组织中mtDNA-4977缺失水平更高。
②mtDNA7436缺失位点为8649bp～16084bp，编码复合体Ⅰ的5个亚单位，复合体Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的各一个亚单位，也是常见的一种缺失。
5．3线粒体DNA丢失
一些非致命性呼吸衰竭、肝功能衰竭、肾功能衰竭以及乳酸酸中毒病人的组织细胞中常见线粒体DNA丢失，造成线粒体形态学改变、细胞生长抑制。
6线粒体DNA损伤的结果
由于线粒体呼吸链功能在细胞基本新陈代谢中的重要作用，编码线粒体呼吸链复合物的mtDNA发生氧化损伤，突变mtDNA数量超过一定阈值，其结果必将导致DNA表达异常、细胞的能量危机。
6．1由于mtDNA中各基因排列紧密，除mtDNA的D环一小段区域外，其他序列无内含子，且部分区域出现基因的重叠，因此，mtDNA的任何突变都会累及基因组中的一个重要功能区域。研究表明线粒体DNA损伤后呼吸链复合物Ⅰ、Ⅳ活性显著下降，氧化磷酸化功能受损，ATP合成减少。突变导致构成线粒体的蛋白质或蛋白质运输机制及离子通道有缺陷，就会产生“代谢性疾病”。
6．2线粒体可启动细胞凋亡的发生，在凋亡级联反应的调节中发挥着十分重要的作用。病理条件下线粒体生成大量自由基，线粒体DNA广泛突变，线粒体电子传递中断、能量生成障碍均可诱发细胞凋亡。对线粒体脑、肌病的研究表明，mtDNA缺失>40％或tRNA点突变>70％时可在肌纤维观察到凋亡。证明线粒体DNA突变致呼吸链功能障碍可能是凋亡发生的病理基础。
6．3缺失突变常使mtDNA片段游离于胞质中，如不被代谢，游离的mtDNA片段穿过核孔，稳定地整合到核基因组中，其过程与病毒DNA插入哺乳类细胞染色体DNA相似。有研究已经在人胚胎、白细胞、几种人细胞系的基因组DNA中检出mtDNA片断，发现HelaTG细胞中c-myc原癌基因有编码细胞色素c氧化酶亚单位Ⅲ基因序列。这种插入常引起核基因的异常表达、癌基因活化和抑癌基因灭活而诱发肿瘤。如果这种插入激活了核基因的衰老相关基因，会启动细胞的衰老进程。
7针对线粒体DNA损伤的保护措施及治疗
由于对线粒体疾病的致病机制还缺乏完善的了解，现在还没有有效的针对性治疗措施。目前常用的一般治疗措施是增加膜稳定性，增加呼吸链酶活性，如辅酶Q10；自由基清除剂，如：VC、VE、谷胱甘肽；中药治疗，如：五子衍宗丸。
7．2特殊治疗
研究证实150多种疾病与mtDNA损伤、突变有关。Sherratt等认为线粒体病的治疗可以从3个方面进行代谢治疗、成肌细胞互补、基因治疗。
综上所述，线粒体DNA有其独特的结构和功能特点，在维持细胞能量代谢中起着重要作用。随着对mtDNA研究的进展，人们发现mtDNA损伤与线粒体脑病、肌病、代谢性疾病、糖尿病、衰老退行性疾病、肿瘤等有着广泛的联系，是这些疾病的分子生物学基础。从1988年初次发现mtDNA病理突变至今，人们在这一领域的研究不足20年，对其确切机制仍然了解不够，更缺乏安全有效的治疗手段。因此针对线粒体DNA损伤的研究有着十分重要的意义。对不同线粒体DNA病理突变致病的分子生物学机制的研究及其针对性的预防和基因治疗措施将是未来研究的主攻方向。