《华西医科大学学报》1999年第1期

冯兴民陈槐卿

华西医科大学生物医学工程研究室

内容摘要

利用不同浓度的趋化物质N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)处理中性粒细胞，并采用硝基蓝四唑(NBX)还原法检测中性粒细胞激活率，结合流室系统定量地研究了在不同切应力作用下，不同激活状态的中性粒细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附的关系。通过显微镜观察、计数及统计分析，结果表明：随着fMLP浓度的增加，中性粒细胞激活率显著增加，两者有着明显的量效关系。

该实验还表明：中性粒细胞经fMLP处理后，与对照组一样，随着切应力增加，中性粒细胞与内皮细胞粘附率按指数曲线下降；中性粒细胞激活率的增加可以引起中性粒细胞-内皮细胞粘附显著增加，当切应力由小变大时，这种作用有减缓的趋势。以上结果提示：

①体内血流产生的切应力可能是阻止中性粒细胞-内皮细胞粘附的重要因素，中性粒细胞粘附随切应力增加而减少有利于体内正常血液循环的维持；

②中性粒细胞激活可以增加其对内皮细胞的粘附。

关键词：中性粒细胞；激活；粘附；甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸；人脐静脉内皮细胞

许多研究结果表明白细胞(尤其是中性粒细胞)激活，以及白细胞与内皮细胞的相万作用，在心脑血管疾病的发生、发展过程中起着重要作用。但是，国内外现阶段只局限于单独研究白细胞的激活或白细胞与内皮细胞的相互作用，而把白细胞激活结合白细胞-内皮细胞粘附研究的报道尚未见到。为此，我们从细胞流变学角度探讨中性粒细胞激活与中性粒细胞-内皮细胞粘附的相关性，以期进一步阐明中性粒细胞-内皮细胞相互作用的机理，探讨脑血管疾病的发病机理。

1实验材料与方法

1．1实验材料

1．1．1主要试剂

胰蛋白酶(Sigma公司)，M199培养液(GibicoBRL)，胶原酶(Sigma公司)，甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)(Sigma公司)，硝基蓝四唑(NBT)(Fluka AG)，淋巴细胞分离液(比重1．077，上海试剂二厂)。

1．1．2实验装置

参见文献。

1．2实验方法

1．2．1胎儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

按Jaffe等的方法培养原代胎儿脐静脉内皮细胞(图1)。细胞长满并融合为单层时进行消化传代，接种于22×11mm2盖玻片上。透射电镜下胞浆有内皮细胞特异性的Weibel-Palade小体(图2)。

1．2．2中性粒细胞悬液的制备

将健康人血(肝素抗凝，201U/ml)低速离心弃去富血小板血浆，余血用右旋糖酐Dexrran200沉降红细胞，将上层细胞悬液置于淋巴细胞分离液(比重1．077)上，离心后取底部细胞并用0．2％NaCl破坏混杂的红细胞，再用Hanks液清洗二遍后，悬浮于含2％小牛血清的Hanks液中，并调至2×106/ml。分类计数中性粒细胞占95％以上，细胞完整，台盼蓝试验表明99％为活细胞。

1．2．3中性粒细胞激活的测定

加0．2ml中性粒细胞悬液于干净、硅化的小塑料试管中，再加等量的0．1％NBT溶液，然后在37℃孵育20分钟，接着在室温(22℃)静置10分钟，取底部细胞涂片、瑞氏染色，在×100倍油镜下计数100个中性粒细胞，其中胞浆有蓝黑色从(formazan)沉淀者为NBT阳性(激活)中性粒细胞。由此可计算出激活中性粒细胞的百分率。

1．2．4实验分组

实验分为对照组、10[-9]mol/L fMLP组(Ⅰ)、10[-8]mol/LfMLP组(Ⅱ)、10[-7]mol/L fMLP组(Ⅲ)，共四组。每组各10例(见附表)。

1．2．5实验操作

各实验组在中性粒细胞悬液加入Hanks液或fMLP后，孵育15分钟，取少量做NBT染色，以测定中性粒细胞的激活率。剩余的中性粒细胞悬液用作粘附特性测定。

将长有内皮细胞的盖玻片放入流室内并密封，缓慢注入经上述处理后的中性粒细胞悬液。在37℃5％CO2孵箱孵育20分钟后，取出并安装到显微镜操作台上。用M199培养液(含2％的新生小牛血清)，以0．05Pa的切应力作用10分钟以冲走未粘附的中性粒细胞，再依次用0．1、0．15、0．2、0．25、0．5、1．0Pa切应力分别作用2分钟，观察并录像。分别计数各组在不同切应力条件卜中性粒细胞与内皮细胞粘附的数目(取10个随机视野的平均数)，并求得粘附百分率，即：

1．2．6统计学处理

所得数据作多个样本均数的F检验，并以q检验作两两比较。

2结果

2．1 fMLP对中性粒细胞激活的影响

不同浓度的fMLP对中性粒细胞激活的影响情况见图3。

由图3可见，随着fMLP浓度的增加，中性粒细胞激活率也增加，二者有显著的量效关系。对照组的中性粒细胞激活率明显低于其它三组(P<0．01)，而fMLP三个不同浓度组之间差异均有显著性(P<0．01)。

2．2 fMLP对中性粒细胞-内皮细胞粘附率的影响

不同切应力下不同浓度的fMLP对中性粒细胞与内皮细胞粘附的影响情况见图4。由图4可见，加入fMLP各组较对照组的粘附率增加，有显著性差异(P<0．01)，Ⅲ组(fiMLP=10[-7]mol/L)较Ⅰ组(fMLP=10-9mol/L)和Ⅱ组(fMLP=10-8mol/L)中性粒细胞粘附率显著增加(P<0．01)。

根据图4，对实验数据进行曲线拟合有如方程：

式中Y为中性粒细胞粘附率(％)，X为切应力(％)。

上述四式可概括为Y=e（a-bx），则a、b为粘附特征常数。

由此可以看出，随着切应力增大，各组中性粒细胞粘附率呈指数曲线下降。若以0．05Pa切应力剪切后粘附的中性粒细胞数为100％，则可得出切应力与中性粒细胞相对粘附率的关系(图5)，随着切应力增大，中性粒细胞相对粘附率逐渐下降，各组均在0．05～0．25Pa段下降较快，以后下降速度减慢。由图5可得出使粘附的中性粒细胞数减少一半的切应力四组分别为0．17Pa、0．25Pa、0．30Pa、0．35Pa。

2．3中性粒细胞激活率与中性粒细胞-内皮细胞粘附率的关系

对实验数据进行线性回归，可以获得中性粒细胞激活率与中性粒细胞-内皮细胞粘附率的关系图(图6所示)。由图中可见，随着中性粒细胞激活率的增加，中性粒细胞粘附率呈直线增加。

三条直线分别代表如下回归方程：

0．05Pa：Y＝9．6601+0．5154X r=0．9913

0．25Pa：Y=1．8951+0．4645X r=0．9957

1．00Pa：Y=0．4034+0．2435X r=0．9991

式中Y为中性粒细胞-内皮细胞粘附率(％)，X为中性粒细胞激活率(％)。

3讨论

从本实验结果可以看出，随着fMLP浓度的增加，中性粒细胞激活率显著增加，fMLP是一种强力化学趋化肽，它被证明能诱导中性粒细胞表面CD11/CD18表达，属速发反应。

本实验中不管是对照组还是三种不同浓度fMLP组均存在着这种现象，随着切应力加大，中性粒细胞与内皮细胞的粘附呈指数曲线减少。这一实验结果与Lawrence等及Kuijper等报道一致，提示体内切应力比较低的毛细血管后微静脉和小静脉是中性粒细胞易粘附的部位，而体内血流产生的切应力可能是阻止中性粒细胞与内皮细胞粘附的重要因素，粘附随切应力增加而减少有利于机体正常血液循环的维持。

本文用经验公式来表达切应力与中性粒细胞粘附率的关系，找出粘附特征参数a、b值。a值与初始粘附有关，b值与切应力从小变大时中性粒细胞粘附减少的速率有关。a、b值能反映不同条件下中性粒细胞-内皮细胞粘附的特征。对照组初始粘附值较小，而当切应力从小变大时，其中性粒细胞粘附减少速率快。而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组初始粘附值均比对照组大，当切应力由小变大时，中性粒细胞粘附减少速率比对照组慢。

我们的实验还观察到，中性粒细胞激活率的增加，可以引起显著的中性粒细胞-内皮细胞粘附增加，而在比较高的切应力下中性粒细胞-内皮细胞粘附随中性粒细胞激活率增高而增加的速率有减缓趋势，这主要表现在高切应力下的中性粒细胞激活-粘附直线的斜率变小。这说明了切应力对于减少粘附的重要作用。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(批准号：39670202)

作者单位：冯兴民(华西医科大学附属第一医院临床微循环实验室)

陈槐卿(华西医科大学生物医学工程研究室成都610041)