高前进李壮志马新东王瑞元
《北京体育大学学报》2005年10期
【摘要】：
随着研究的逐渐深入和实验技术的改进，人们对细胞骨架有了丰富的认识。细胞骨架包括微丝、微管和中等纤维，其在细胞中具有多种重要的生物学功能。
在骨骼肌细胞中细胞骨架按位置不同分为肌小节内、肌小节外和肌细胞膜骨架蛋白。
结蛋白desmin是骨骼肌细胞中主要的中等纤维，是重要的骨架蛋白。
整联蛋白integrins和抗肌营养不良蛋白dystrophin复合物通过亚细胞膜分子和跨膜分子将骨骼肌的收缩成分与细胞外基质相连。
细胞骨架能稳定肌小节结构，由于肌节过度伸展或蛋白酶激活可能会损伤骨架蛋白。这些可能是运动训练造成肌肉微损伤和骨骼肌疾病症状，例如肌营养不良症的机制。
【关键词】：骨骼肌；细胞骨架；结蛋白；抗肌营养不良蛋白
1、细胞骨架概述
细胞骨架按其功能性可下这样的一个定义，即它们是负责细胞空间组织的结构。细胞骨架分为三种类型的蛋白质纤维，即微丝(microfilament)、微管(microtubule)和中等纤维(intermediatefilament)。它们分别是不同蛋白质以不同方式组装成不同直径的纤维。现在这些纤维蛋白质都能在体外解离和重新装配，使得人们能够对它们的化学性质进行分析。
微丝专指由肌动蛋白(actin)组成的、直径约7nm的纤维。肌动蛋白和肌球蛋白(myosin)早已知是在细胞中更普遍，可能也是更主要的利用细胞化学能产生运动的机械-化学系统。所有的真核细胞都含有肌动蛋白，并且在多数细胞中，它是含量非常高的细胞质蛋白。肌球蛋白在肌肉细胞和非肌肉细胞中总是和肌动蛋白紧密相关的。其他一些结合蛋白可能与肌动蛋白相互作用使微丝表现出独特的结构状态，并使之能够执行尤其多样的功能，包括收缩和非收缩功能。
微管是直径24～26 nm的管状纤维，长度变化很大，常延伸到像纤毛、鞭毛或某些原生动物的轴伪足这样一些长的细胞突起中。微管是由α和β管蛋白和少量微管结合蛋白的聚合作用而形成的。微管蛋白是构成微管的主要蛋白，它具有α和β两型，两个分子联结在一起形成二聚体(dimers)，由它螺旋盘绕装配成微管的壁。13个二聚体构成一周，因此在微管的横切面上有13个原纤维。微管实际上是所有真核细胞的生活周期或发育史的某个时候在其细胞里找到的一种用途异常多的蛋白质聚合体，是真核细胞所仅有的普遍存在的结构。
中等纤维和微管、微丝，是构成细胞质骨架的三种主要纤维，在电镜下呈直径8～11nm的中空管状。由于其直径在微管和微丝之间，被命名为中等纤维。从细胞水平来看，中等纤维在细胞质内形成一个完整的支撑网架系统。它在外面与细胞膜和细胞外基质直接联系，在内部与核表面利核基质直接联系，中间与微管、微丝及其他细胞器联系，因此在细胞内和细胞间都起着多方面的结构作用。
在细胞内，许多生物学上的过程需要有细胞骨架的参与。这包括有丝分裂、细胞运动、对细胞质的组织、细胞器在细胞内的运动、细胞形态的维持以及膜相关的诸多功能等。目前随着生物学研究技术的不断改进提高，使得细胞骨架的研究已从形态观察为主，迅速推进到分子结构、功能利调节的研究。其丰富的研究成果及其在生物医学领域中的重要性已使其成为了一个热门研究领域。
2、骨骼肌细胞骨架概念及分类
骨骼肌细胞骨架由蛋白质构成，它的主要功能是联结和锚定细胞内的结构成分。利用快速冷冻蚀刻技术可见，细胞质充满长度利直径不等的纤维，它们相互交联成三维网状结构，细胞骨架网中含有肌动蛋白纤维、微管和中间丝蛋白纤维，这些纤维的交联方式非常复杂。核糖体、细胞器被锚定在细胞骨架上。
骨骼肌细胞骨架按位置不同可分类为肌小节内骨架、肌小节外骨架和肌细胞膜骨架。
Tinin和Nebulin是肌小节内的主要骨架蛋白，它们沿肌原纤维长轴排列在肌节内。Tinin从Z盘伸展到M带，1983年Lashall等采用免疫电镜初次发现tinin的定位，现在认为tinin是连接Z盘和Myosin之间的蛋白丝，从Z盘至M线，在肌节中具有一定的弹性，并维持Myosin的中间状态。Nebulin在细胞中的定位是1988发现的，在肌肉放松的状态下nebulin起源于Z盘，延伸至I带，连接于Z盘与Z盘之间，与A带中的actin平行排列，主要作用是保持actin的正常结构。
肌小节外细胞骨架主要由中等纤维(intermediatefilaments)组成，它位于肌原纤维周围，连接Z盘、核膜和肌细胞膜之间。在骨骼肌细胞确认的一些中等纤维包括desmin、vimentin、nestin、synemin、paranemin、lamins andcytokeratins。然而，主要的肌肉特异性的中等纤维是desmin，其位于肌节Z盘周围，连接相邻的Z盘与肌细胞膜。
肌细胞膜骨架蛋白包括跨膜的和与膜相连的蛋白，例如vincullin、spectrin、dystrophin、integrins、ankyin等，这些蛋白将肌细胞内的肌原纤维和细胞外的基质间接地联结起来，这种联结是通过细胞膜上专门的区域costameres(肋小节)(图1)。Costameres在肌细胞膜上呈周期性分布，costameres包含两套细胞-基质相互作用受体复合物dystrophin-glycoprotein complex(DGC)和integins-talin、vinculin complex。Dystrophin-glycoprotein complex(DGC)是细胞膜上主要的具有重要功能的结构，也称为dystrophin-associated protein complex(DAPC)。这个复合物是多分子的跨膜复合物，联结细胞内骨架蛋白和细胞外基膜。由DGC调节的这种联结对维持肌细胞完整性和肌力的产生起关键作用。DGC包含细胞外的和跨细胞膜的蛋白复合物α/β-dystroglycan、sarcoglycan的四个亚单位和sarcospan。α/β-dystroglycan是一个异源二聚体，与细胞外基质laminin-2相联结。DGC复合物的跨膜成分与信号分子nNOS，dystrophin相联。
DGC复合物基因变异可导致各种肌营养不良症。例如，杜氏肌营养不良症(DMD，Duchemae MuscularDystrophy)是由于缺乏dystrophin；贝克尔肌营养不良症(BMD，BeckerMuscular Dystrophy)由于dystrophin以截短的形式表达；肢带肌营养不良症(LGMD，Limb-girdleMuscular dystrophies)，由于Sarcoglycans亚单位中的某一个变异所致。先天性基质肌营养不良症(CMD，MerosinCongenital Muscular Dystrophy)由于基质中缺乏laminin-2所致(图2)。由于DGC在人类骨骼肌疾病中有重要意义，因此DGC已成为众多研究的焦点。在肌肉细胞膜结构中，DGC对维持神经-肌肉接触点和肌肉-肌腱联结点的成熟和稳定都发挥着重要作用。
在肌细胞膜上另一个关键性的结构是integrinsassociated to talin and vinculin complex。它与细胞基膜中laminin的各个亚型都有联结，在细胞内与微丝相联结。对细胞彼此之间的附着相当重要，还参与细胞信号转导。
3、运动和骨骼肌细胞骨架蛋白
3．1 Desmin与骨骼肌微损伤机制
在骨骼肌细胞内除收缩蛋白以外，肌细胞还包括骨架蛋白。骨架蛋白在肌细胞内稳定和联结收缩蛋白，使收缩产生的张力沿肌纤维长轴利肌纤维的侧面传递。肌细胞内的骨架蛋白对预防骨骼肌离心收缩造成的损伤有重要作用。Desmin是细胞内结构利胞外基质联结系统中的一个重要的蛋白，可能是离心收缩引起肌小节紊乱的重要机制。Desmin是位于Z盘周围联结Z盘和Z盘，同时将Z盘和肌细胞膜联结到一起的结构蛋白，在稳定肌节结构和沿肌纤维各个方向传递张力的过程发挥重要作用。Lieber和Friden等在一组系列的研究中，使用免疫组织化学技术研究了Desmin可能发生的变化。在头一个实验中他们研究认为在一些肌纤维Desmin蛋白缺失是离心运动造成肌肉损伤的特点，而且Desmin蛋白丢失的肌细胞在损伤后即刻收缩蛋白结构正常。在第二个实验中，Lieber等使用在兔后腿皮下植入电极刺激坐骨神经，使后腿产生离心收缩，观察了兔胫骨前肌利趾长伸肌中desmin随时间变化而丢失的情况，一开始的结构改变是5min后趾长伸肌(EDL)即有2．5％±0．63％的desmin标记丢失(P<0．05)，胫骨前肌(TA)丢失不明显(0．24％±0．19％)，但是15min后，EDL利TA的desmin丢失率分别达到7．4±1．4％和4．6±1．0％(P<0．05)，第3 d时达到高峰，分别丢失30％以上和15％左右。Komulainen利用大鼠模型也发现运动后即刻和6h后desmin标记丢失。这些结果表明Desmin蛋白丢失可能是离心运动损伤的一个早期特点，这些Desmin染色阴性肌纤维后来很多都显示出tinin染色增多和至后出现收缩蛋白降解变性。这些研究形成了对离心运动损伤机制的假说：
1)肌纤维被动过度伸展引发了肌细胞内钙离子局部升高；这种增高可能是由于被动张力刺激张力敏感离子通道使该离子内流，或是由于肌浆网受损不能将钙离子泵回肌浆网，或是由于T管系统或肌细胞膜受损所致。
2)细胞内升高的钙离子激活蛋白酶，例如calpain，导致选择型地中性蛋白水解，中等纤维网分解。已经证实Desmin是calpain的作用底物，而actin利myosin不是，这可以解释为什么Desmin标记丢失的纤维收缩蛋白结构仍然完好。
3)至后由于蛋白酶水解作用使Desmin网被破坏，肌原纤维结构被破坏，不能产生正常的收缩力。
Belcastro也汇报了在跑台跑后，大鼠后肢肌肉有增高的calpain活动。他认为先是机械外力引发肌细胞损伤，然后是肌细胞内钙离子增多，导致后期的炎性反应。
3．2骨骼肌细胞膜骨架蛋白与肌肉微损伤机制
运动导致的肌肉酸痛(Exercise-inducemuscle soreness)肌肉微损伤(Exercise-induce mus-cle damage)是运动训练和体育锻炼中非常普遍的现象。Hough在1902年先建议运动导致的延迟性肌肉酸痛是由于肌纤维损伤引起。随后，大量的研究认为，剧烈的、超过习惯负荷的运动(尤其包含离心收缩的运动)会使肌细胞结构、细胞外基质损伤，而且这种损伤伴随着肌肉功能下降。组织学和超微结构观察对肌细胞膜，肌原纤维和骨架蛋白的损伤提供了直接的证据。然而骨骼肌微损伤的机制仍然不清楚。目前对其损伤机制主要有几种假说，如：
1)机械假说：在肌肉收缩和弹性成分中，由于高张力(尤其是伴随离心收缩的)运动会造成结构的损害；
2)自由基攻击假说，认为运动使氧自由基增加，脂质过氧化加强，从而使细胞膜受到攻击损伤，进而肌细胞内容物漏出；
3)骨骼肌收缩蛋白和结构蛋白代谢平衡：胞浆钙、线粒体钙大量堆积，抑制细胞呼吸，造成氧化磷酸化的损害，使细胞内钙进一步升高，激活钙依赖蛋白水解酶，使Z线、肌蛋白酶和原肌球蛋白降解，对肌纤维结构造成了严重的损害。
以上几种假说一致认为肌细胞膜损伤、肌细胞膜完整性的丧失是胞浆内容物泄漏和胞外钙离子大量进入的直接原因。因此对骨骼肌细胞膜尤其是细胞膜骨架蛋白和膜上离子通道的研究引起了学者们的巨大兴趣。Dystrophin是抗肌营养不良蛋白聚糖复合物(dystrophinglycoprotein complex DGC)的主要成分，DGC跨细胞膜连接着肌细胞内骨架蛋白和细胞外的基质。这种跨膜复合物的丢失、分解使收缩引起的肌纤维损伤大大增加，使肌细胞膜损伤导致肌纤维坏死。
Richard和DonatellaBiral用荧光免疫标记抗体的方法研究了离心收缩后骨骼肌细胞膜骨架蛋白(a-actinin、desmin、dystrophin、sarcoglycan、β-spectrin)和细胞间质蛋白(laminin，fibroneetin)的变化。在离心运动引起的损伤后，肌纤维之间有明显的dystrophin标记丢失，而其它膜骨架蛋白受影响很小。说明dystrophin更易受到攻击，并且其可能在力量传递中占有重要地位。
Sarcoglycan(肌聚糖蛋白)是一个多分布、位于膜上的蛋白聚糖复合物，与DGC相连。人类sarcoglycan基因变异引起肢带肌肉营养不良症(limb-girdle musclar dystrophy LGMD)；而Dystrophin基因变异引起杜氏或贝克尔肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular drstrophy DMD/BMD)。L．Feasson，D．Stockhohn等人应用蛋白免疫印迹分析法研究了离心运动引起的人肌细胞膜损伤的情况，发现离心收缩使a-sarcoglycan分解、丢失，Desmin没有变化，运动后14d desmin合成增加有显著性意义，而a-sarcoglycan14 d时蛋白水平仍然处于较低水平，作者还在此基础上研究了小热休克蛋白的表达情况，发现运动引起的Hsp27、aB-晶状体蛋白表达逐渐增加，运动后1d蛋白表达达峰值，14d仍然处于较高水平与对照组相比有显著差异。作者认为a-sarcogiycan属于DGC复合物，对稳定肌细胞膜起重要作用，虽然a-sarcoglycan表达水平下降的准确意义不明，但是可以肯定其丢失是与内容物CK、LDH、肌球蛋白等的泄漏相关，此结果是与a-sarcoglycan基因敲除鼠表现出的肌膜完整性丧失，肌力下降，和显著的DGC不稳定的结果相一致的。a-sarcoglycan蛋白水平的降低也可能调节细胞内钙离子的浓度，因为，a-sarcoglycan有一个细胞外ATPase的活动，其减少时ATP酶增多，进而使P2X受体活动增强，P2X受体是一个非特异性的离子通道，a-sarcoglycan蛋白水平的下降可导致持续的P2X受体活动，而使胞内钙超载。
以上的研究表明了膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在保持细胞膜完整性方面的重要性。这些骨骼肌细胞膜DGC复合物成份丢失发生在骨架蛋白desmin染色丢失之前或者发生在actin出现紊乱之前，因此这些蛋白复合物缺失可能有一个引发一系列损伤事件的源头作用。对于接下来的肌原纤维再重建和预防下一次的离心运动损伤具有意义。
4、小结
运动性骨骼肌微损伤和延迟性肌肉酸痛多年来一直是运动医学的研究热点。细胞骨架遭到破坏可导致骨骼肌微损伤和延迟性肌肉酸痛，因为细胞骨架蛋白对维持肌节的正常结构起着非常重要的作用，运动过程中，高张力的机械牵拉会使细胞骨架的正常结构受到影响，从而造成肌肉收缩蛋白结构破坏。中间丝蛋白desmin和膜骨架蛋白复合物是骨骼肌中重要的骨架蛋白，是研究离心运动时骨骼肌细胞内部变化的敏感指标。目前对desmin在动物和人体上的实验产生了不一致的观察结果，因此有关人体的这方面的研究还需进一步深入。