作者：秦瑞峰顾晓明秦晓春

《第四军医大学学报》2001年01期

【作者单位】：第四军医大学口腔医学院颌面外科!陕西西安710033

第四军医大学口腔医学院颌面外科!陕西西安710033

黑龙江省龙江广厚医院

摘要：

目的：

对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究。

方法：

本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成。

结果：

C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象；而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象。

结论：

在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡。

0引言

细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用。凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，终形成新月状小体；其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局。凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践。骨骼肌肌母细胞分化发育，先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构。C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mL·L-1胚牛血清的DMEM培养基可诱导其分化，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化。我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×105·L-1，接种于100mL·L-1胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mL·L-1 CO2孵育箱培养（37℃）。培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mL·L-1胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mL·L-1胚牛血清的DMEM），分别24、48和72h换为分化培养基的进行实验。

1.2方法

1.2.1流式细胞仪对细胞的检测

按文献，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×106mL-1，4℃PBS洗涤，700mL·L-1冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μg mL-1碘化丙啶，1mL·L-1Triton X-100，0.1mmol·L-1EDTA（Na）2，50μg mL-1Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，>610nm滤色片检测，对细胞进行分析。

1.2.2 TUNEL法

按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行。常规细胞爬片，20μg·mL-1蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，之后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析。凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色。

1.2.3电镜检测

常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察。

1.2.4 DNA的电泳分析

细胞经2.5g·L-1胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集。随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20g·L-1琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录。

2结果

2.1肌细胞分化过程中细胞周期

C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）。

2.2形态学观察和TUNEL法染色

光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合。对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）。

2.3电镜观察

GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）。

2.4细胞基因组DNA的电泳分析

肌细胞于分化培养基培养24h、细胞出现梯状DNA，尤以48h悬浮细胞显著（Fig4）。

3讨论

迄今已发现许多因素都可诱导细胞凋亡，生化机制还不十分明确。一般认为程序化细胞死亡过程中核DNA的降解是由于一种Ca2+，Mg2+依赖性内切酶活化引起的。多细胞有机体的发生、发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合，即细胞周期的正常运行，细胞的增殖和凋亡的平衡。对肌肉细胞凋亡现象的研究将对揭示肌细胞恶变、老化、退变性肌病等的发病机制及其治疗有重要意义。

FCM是检测细胞凋亡有效而灵敏的方法，为观察凋亡提供了新的手段；凋亡细胞检测技术TUNEL法，是利用凋亡细胞生化特征的先进检测技术，具有很高的灵敏性。本实验中肌细胞分化的特定时期即肌母细胞在分化培养基培养24h和48h，TUNEL法染出了凋亡细胞，此外，DNA凝胶电泳分析出现反映核小体断裂的DNA梯状带。以上结果表明，在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，这在肌肉组织重建有积极的意义。另外，凋亡的发生具有明显的时间性，分化早期（24h）检测出凋亡细胞数量较少，可能原因是此期间为特异性基因开放期，分子水平反映活跃，形态改变不太显著；分化后期（72h）不再发生凋亡，主要原因在于诱导72h后肌母细胞已经融合形成肌管，肌管是终末分化的肌细胞，不能再进入细胞分裂周期。不过，近期有的学者SV40大抗原引入肌管，终末分化的肌管重新进入细胞周期，出现减数分裂和凋亡，说明肌管仍具有凋亡发生的机制。

细胞凋亡时伴有多种基因转录和蛋白质合成。c-myc是调控细胞增殖的主要基因，c-myc的表达产物是一种转录因子，与细胞增殖分化及癌变有密切关系。Evan等选用大鼠成纤维细胞Rat1/myc为实验模型研究发现，当有某些因素（低血清浓度，抑制细胞周期因子，抑癌基因）存在时c-myc基因的表达与细胞程序性死亡密切相关。本实验在诱导肌细胞分化时采用20mL·L-1血清的DMEM培养基，c-myc可能在细胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的调节过程的机制仍很不清楚。总之，肌母细胞分化、发育的过程中出现凋亡现象可能为保证肌肉发育成熟所必须，为清除不再需要的肌细胞提供了一个有效机制，它的研究对于肌肉系统疾病认识将有很大帮助。