(北京心肺血管医疗研究中心，血液流变学研究室，北京100029)
郭金良李勇孙素琴
(清华大学化学系，北京100084)
摘要：
为探明自由基引起红细胞流变性改变的作用机理，我们对体外自由基作用三十分钟前后红细胞膜剪切弹性模量、细胞表面指数、膜脂质分子和蛋白分子流动性进行了比较分析。发现自由基作用后，红细胞膜剪切弹性模量、膜脂质分子和蛋白分子的相对旋转时间分别增加了百分之49.8、百分之49.5和百分之191.4，而红细胞表面指数无变化；此外，随着自由基浓度的降低以上变化也随之减轻；在自由基损伤后的第三小时，上述改变部分回复。本研究说明，自由基引起脂质和蛋白分子流动性降低共同导致红细胞膜剪切弹性模量的增加，并且一定浓度自由基对红细胞流变性的损伤是部分可逆的。
关键词：自由基；红细胞膜剪切弹性模量；膜脂质分子流动性；膜蛋白分子流动性
分类号：R318.01
0前言
除了神经体液调节因素和灌注压外，影响微循环灌注的主要环节还有毛细血管床的完整及良好的红细胞流变性。当红细胞流经内径小于自身的滋养毛细血管时需要变形才可通过。已有许多关于疾病病程中红细胞的变形特性被改变的报道。红细胞的硬度不仅受细胞内外多种因素的影响，同时还取决于细胞膜的化学成分(脂质和蛋白)及它们的流动性。当某些物理化学的、感染或其他的病因引起红细胞膜成分、结构和代谢功能变化时都将影响膜流动性进而影响整个细胞的变形性并由此干扰微循环灌注。
自由基产生过量或出现在细胞的某些部位可造成病理学改变，特别是以氧为核心的自由基已被证明与缺血/再灌注期间的中枢神经系统和心脏的病理改变有关。缺血/再灌注期间脂质过氧化不仅破坏了细胞膜的完整性，同时还引起游离脂肪酸释放进而导致了水肿和花生四烯酸代谢等病理学变化。A.M.Phelan报道了在脑缺血/再灌注期间，毛细血管内皮细胞膜脂质区流动性明显降低，认为与此期间产生的自由基损伤有关。
但到目前尚未见有关自由基对红细胞膜分子流变性损伤机理的研究报道。为探明自由基对红细胞流变性的作用机理，本文除观察了自由基对离体健康人红细胞变形性的影响外，还探讨了自由基对细胞膜脂质和蛋白分子流动性的作用及其可能的途径。
1材料和方法
(1)自由基体系
按照下列方法配制高、低浓度的羟自由基体系。高浓度：按1∶1∶1的容积比将3%的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之2.7的NaCl混合制成等渗、pH7.0的羟自由基体系；低浓度：按0.5∶1∶1.5的容积比将百分之3的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之1.8的NaCl混合制成等渗、pH7.0的羟自由基体系。分别在以上体系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉剂DMPO(5，5-diethyl-1-pyrroline-N-oxide)捕捉自由基，并于室温下用ESR(electronic spinresonance)-电子自旋共振波谱仪测定(BRUKERER-200D，微波功率SP=10mW(13db)，调制幅度MA=5G，放大增益GN=5×104，中心磁场CF=3470G，扫场宽度SW=100G)，证明配制后即刻已产生自由基且在1h内其浓度不变。
(2)自由基对红细胞的损伤及恢复
10名健康成人新鲜红细胞(男女各5名)经等渗磷酸缓冲液(PBS)清洗两遍后分别与以上两自由基体系在室温条件下作用30min。作用后的红细胞经PBS清洗两遍后再于室温条件下放置3h。
(3)红细胞流变参数测定
在前期的预实验中，采用根据M.Paulitschke等人的微吸管技术而设计的微管细胞流变仪对自由基作用后的10只大鼠红细胞流变性变化进行的观察发现：当用内径为1.6～2μm的毛细管在10cmH2O的负压吸引下，每只随机测定8～10个细胞，即观察到红细胞膜剪切弹性模量显著增高(P<0.05)。
本研究中仍采用以上微吸管法，自由基作用前后的每份红细胞由内径为1.6～2μm的微吸管在8cmH2O的负压下(ΔP)随机吸取红细胞悬浮液中10～12个细胞，并由图象分析系统计算出每个红细胞膜的剪切弹性模量、细胞表面指数等细胞流变学指标，分析红细胞刚性化程度。图1所示为微吸管测定红细胞流变性的方法，先后测量微管内半径RP、红细胞被吸入微管内部分的长度L和红细胞未被吸入微管部分的直径D，经由计算机根据下列改进的M.Paulitschke]经验公式计算红细胞膜剪切弹性模量μ、细胞表面指数Si。膜剪切弹性模量μ增加和细胞表面指数Si下降，分别代表膜流动性降低及细胞相对体积增大，表明细胞流变性下降，反之亦然。
上式中K1=2.45，K2=0.63
(4)红细胞膜分子流动性测定
将每份经PBS清洗两遍后的两个100μl红细胞分别再悬浮于500μl的PBS中，其一加入10-3M/L的3-MCP[3-maleimdopropyl(-carbamoyl)-proxyl]8μl充分混匀，标记红细胞膜蛋白分子；另一加入10-3mol/L的12-DSA(12-doxyl-strearic acid)20μl充分混匀，标记红细胞膜脂质分子区。室温标记两小时后离心去上清。在室温条件下用电子自旋共振波谱仪(ESR)分别测定以上标记样品的ESR信号(除了脂质和蛋白分子标记物的SW分别为100G和50G外，其他仪器参数相同，即SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104)，由于标记物分子的相对旋转时间反映这些分子运动时的周围分子环境，因此根据下式分别计算膜蛋白(τp)及脂质分子(τl)标记物的相对旋转时间以表示膜蛋白和脂质分子流动性：
上式中τ为分子相对旋转时间，ΔH(0)为ESR谱的中心峰的峰-峰宽，h(1)、h(0)和h(-1)分别为低场峰、中心峰和高场峰的峰高(如图2所示)。
(5)数据分析
用T检验对自由基作用后的各实验参数与实验前有关参数进行医学统计学比较，设定P<0.05时具有显著性差异，各参数以均值±标准差(±SD)表示。
2结果
表1所示为自由基作用前后红细胞膜剪切弹性模量和细胞表面指数的比较。无论与较高浓度或较低浓度自由基作用30min均引起完整红细胞膜的剪切弹性模量(μ)明显增高，增幅分别为百分之49.8和百分之42.7；3h后尽管μ值有所降低，但仍明显高于作用前。在此期间细胞表面指数无显著改变。
自由基作用30min后无论是蛋白或脂质的标记物分子的相对旋转时间都大幅度延长，表明被标记的膜分子有序性增加即流动性降低，其中以蛋白的变化较大；3h后，膜分子流动性有不同程度的回复，但是蛋白分子回复较少，而脂质分子流动性几乎回复到作用前水平(表2)。
本研究中发现，自由基作用后红细胞膜蛋白标记物3-MCP的ESR信号强度增加了数倍至十数倍(表3)，与蛋白流动性改变一样，三小时后尽管信号强度有所回复，但仍较作用前高数倍。由于3-MCP是与细胞膜蛋白的巯基(-SH)特异性结合，因此信号的增强提示自由基损伤后红细胞膜表面暴露的蛋白巯基数量明显增加，说明蛋白分子结构发生了变化，而且这一变化的可逆性较差。
与对照相比，随着自由基浓度的降低有关参数的变化程度也随之减轻。
3讨论
自由基是自然存在并是许多生理过程所需的含有不配对电子的活性物质。但产生过量或出现在不合适的细胞部位将会导致病理学改变。前期的研究发现易受自由基攻击的生物结构是脂双层。膜磷脂对氧自由基的攻击非常敏感的主要原因是：一、其所含的多不饱和脂肪酸的不饱和键是自由基攻击的很好的靶部位，二、分子氧在膜疏水区的溶解度高于相应的亲水区。已证明在生物体中产生的氧衍生出的自由基导致了脂质过氧化、炎症和水肿等组织损伤。缺血/再灌注后膜的完整性的破坏及游离脂肪酸的释放与脂质过氧化物的产生相关，并由此促进水肿和花生四烯酸的代谢等病理变化。Bruch等人利用不同的电子顺磁脂肪酸氧化氮探针对人工膜的研究发现，脂质过氧化引起膜内部相应部位的改变。Anne M.Phelan通过动物实验发现，当大脑半球缺血/再灌注后只有毛细血管内皮细胞膜疏水区的氮氧自旋标记物12-DSA所指示的区域的微粘度明显增加，而5-DSA和16-DSA所指示的膜脂质分子区有序性未发生变化，这与Zaleska等人在脂质体被自由基损伤后的发现一致。
因为在氧转运中大量的氧反复穿过膜，并且膜含有丰富的非配对多不饱和脂肪酸，在这些脂肪酸中与C=C烯烃键相邻的亚酰基又易失去氢原子，而红细胞内的血红蛋白又为损伤性自由基的产生提供了氧化还原催化剂——铁，所以红细胞易受到过氧化损伤。当红细胞膜受到过氧化时，自由基更易攻击含四个或更多烯烃键的多不饱和膜磷脂的酰基链，这些酰基链主要是由花生四烯酸和二十二碳四烯酸构成，过氧化终会引起这些酰基链中烯烃键的减少。
红细胞的流变性受膜流动性、胞浆粘度和细胞体积的影响，其中一个或几个因素发生变化都会引起整个红细胞的变形性降低，进而影响氧转运和微循环灌注。红细胞膜是典型的脂双层蛋白镶嵌结构，部分膜蛋白构成的细胞膜骨架不仅起着支撑细胞膜、维持膜完整性的作用，其自身也可变形；同时它还起着调控和限制膜脂分子的运动空间的作用，因此是膜流动性的重要决定因素；其他膜蛋白如一些酶类、一些受体类等等除自身的旋转运动外也发生膜上的水平运动。膜脂分子具有旋转、链摆动和水平运动等三种运动方式，无论何种方式都会受到分子结构及周围分子运动的影响。因此红细胞膜的流动性是由膜脂分子和蛋白分子流动性及它们彼此相互作用所决定。
本文中自由基作用后红细胞膜剪切弹性模量明显增加而不伴有细胞指数的明显改变说明了自由基引起细胞膜的刚性化是红细胞流变性降低的主要原因；而自由基作用后除12-DSA指示的膜脂质分子有序性明显增加的结果与上述作者的发现一致外，同时还发现膜蛋白分子的有序性也明显增加，其增幅大于脂质的变化，说明脂质和蛋白分子流变学的变化共同作用于以上膜剪切弹性模量的改变。如前所述，自由基引起了膜脂质过氧化主要表现为磷脂疏水区酰基链中烯烃键的减少、分子结构的变化，此外我们的同期研究发现自由基还引起膜磷脂亲水区中含磷基团的磷-氧双键与磷-氧单键(P＝O/P-O)的比例异常，这是本文中膜脂分子流动性降低的主要原因。有意义的是本文发现在自由基作用后膜蛋白分子标记物信号强度明显增强和标记物的强固定化同时出现，不仅提示了膜表面蛋白暴露的标记位点增加且其中的部分位点是在蛋白分子的内部，提示自由基引起了膜表面蛋白楔状缺损的分子结构变化，这是本文中膜蛋白流动性降低的主要分子生物学基础。
至今未曾见到有关自由基损伤后红细胞流变性回复情况的研究报道。本文对自由基损伤后红细胞流变性有关指标的动态观察表明，三小时后无论是细胞膜的剪切弹性模量或膜脂质、蛋白分子流动性均有不同程度的回复，其中脂质分子流动性几乎完全回复到作用前水平；而蛋白分子流动性回复比较小，这与蛋白分子标记信号的回复情况相似。提示自由基对红细胞流变性的损伤是部分可逆的，这主要是由于膜脂质分子流动性的回复，而就红细胞流变性不能完全回复的主要原因是由于自由基损伤导致了蛋白分子结构的重构(一旦蛋白分子结构发生重构，其损伤或变化则难以回复)，使蛋白分子与周围分子的关系发生变化从而导致流动性不易回复。从本文中的结果还可看出自由基对红细胞流变性的损伤程度与自由基浓度有关。
根据上述各点我们认为，在许多具有产生大量自由基的临床条件下(如心肌梗塞、脑梗塞、开心手术期间的缺血/再灌注和炎性过程)，红细胞膜上的磷脂和蛋白分子在自由基的攻击下而发生结构的改变，这些变化不仅使分子自身的旋转运动和链摆动降低，同时通过改变分子间的关系而限制周围分子的运动，从而降低了完整红细胞膜的流动性并终会导致红细胞变形性的下降影响循环及微循环灌注。
国家自然科学基金、北京市自然科学基金支持项目
1995年5月30日收稿，1995年10月20日修回