【作者】徐文静张君陆环谢建新
【机构】石河子大学医学院省部共建新疆地方病与民族高发病教育重点实验室，新疆维吾尔自治区石河子832000
【刊名】《国际内分泌代谢杂志》2009年第29卷第B04期，47-50页
【关键词】内质网应激未折叠蛋白反应内质网相关性死亡
【文摘】
已知缺氧、营养物质缺乏、氧化应激、异常糖基化反应、钙代谢紊乱等都能引起内质网应激反应，并表现为3个步骤：蛋白质合成暂停、内质网应激蛋白表达和细胞凋亡等，每一过程的分子机制现已逐步被揭示。当细胞内质网稳态遭到破坏时，细胞不能正确合成蛋白质，也不能发挥正常的生理功能，甚至会出现细胞凋亡。掌握内质网应激过程对进一步理解糖尿病、心脑组织缺血性梗死、神经退行性病变等多种疾病的发生机制有十分重要的理论意义。
真核细胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在内质网(ER)中合成后，经过翻译后修饰、折叠和组装，由高尔基体进一步加工后转运到膜上或分泌到胞外。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡等各种因素作用下，新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰，将引起未折叠蛋白在ER中堆积，使细胞产生内质网应激(ERS)，并激活未折叠蛋白反应(UPR)信号转导通路，导致细胞自身通过改变其转录和翻译过程，减少蛋白的合成，降低进入内质网的蛋白量，同时上调内质网中分子伴侣和折叠蛋白的表达，增强内质网的蛋白折叠功能。细胞还可以通过上调内质网蛋白降解途径的相关基因表达，加速未折叠蛋白的降解过程，以提高细胞在有害因素下的生存能力。
ERS是在应激条件下，为维持细胞内环境稳定，保持细胞生存，细胞启动的自我保护反应机制。目前已证实，内质网应激时细胞至少发生3个方面的反应，现综述如下。
1 UPR
1．1未折叠蛋白分子伴侣
真核细胞中，分泌蛋白和膜蛋白在翻译后，内质网修饰和转运合成的蛋白质到达正确的目标位置或细胞外区域。蛋白质的正确折叠需要内质网中蛋白质分子的参与，其中主要有3类分子伴侣：热休克蛋白(HSP)家族的糖调节蛋白(GRP)78；外源凝集素类的钙连接蛋白/钙网织蛋白(CNX/CRT)；蛋白二硫化物异构酶家族中的巯基氧化还原酶。
GRP78也称为免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，是ERS的主要分子伴侣，也是该反应的关键分子。BiP由N端的ATP酶结构域和C端的待折叠蛋白结合结构域组成。生理状态下，BiP结合于内质网膜上的感应蛋白双链RNA激活蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、肌醇需求激酶(IRE1)和转录活化因子(ATF)6，使其处于未激活状态。当未折叠蛋白与BiP结合增加时，导致BiP与感应蛋白结合减少，激活感应蛋白及其后的UPR。
1．2 UPR及其通过内质网膜的信号转导通路
内质网中过多的未折叠蛋白将激活细胞内重要的信号转导途径，引发UPR。UPR可以将内质网管腔内蛋白折叠情况反馈到细胞浆和细胞核内，诱导内质网驻留蛋白和折叠相关酶的表达，增大内质网管腔来提高内质网的蛋白折叠能力；也可以通过短暂下调，甚至关闭蛋白质合成相关的转录和翻译，以降低内质网蛋白质的生物合成，或者通过增强内质网蛋白降解来增加未折叠蛋白清除能力。在ERS的情况下，哺乳动物的UPR信号转导形成了3条互相联系的通路：跨膜蛋白IRE1/内质网核信号1(ERN1)、PERK/PEK(Pancreatic enriched kinase)、ATF6在转录和翻译水平介导3条不同的信号通路。
1．2．1 PERK通路
PERK属于真核细胞蛋白质翻译起始复合体eIF2α蛋白激酶家族成员，是位于ER的Ⅰ型膜蛋白，N端感受ERS信号，存在非配体依赖性的二聚化结构域。非ERS时二聚化位点被BiP遮盖，C端有丝/苏氨酸蛋白激酶功能域。PERK活化后能够特异性地磷酸化eIF2α51位丝氨酸，下调胞内蛋白合成的整体水平。Koumenis等观察到，缺氧能激活PERK，磷酸化eIF2α，使小鼠胚胎成纤维细胞稳定表达PERK显性负相关等位基因。而PERK缺失的纯合子小鼠胚胎成纤维细胞在缺氧条件下，磷酸化eIF2α减弱，蛋白质合成抑制减少，与野生型细胞相比，在较长的缺氧条件下细胞存活显著减少。而将突变的eIF2α(S51A)等位基因导入小鼠胚胎成纤维细胞后，由于eIF2α(S51A)不能被PERK磷酸化，这些细胞表现为对缺氧的敏感性增加。
1．2．2 IRE-1通路
ERS能导致IRE-1腔内结构域与BiP解离，IRE-1寡聚化，自身磷酸化激活其RNA酶活性。两者的底物都是X-盒结合蛋白1(XBP1)mRNA，其编码碱性含有亮氨酸锌指结构的转录因子。IRE-1的RNA酶活性切割XBP1mRNA，使其成为成熟的mRNA，其编码的XBP1蛋白能增强分子伴侣蛋白BiP的转录活性。分子伴侣蛋白表达上调在ERS的调节中具有重要作用，可促进ER功能恢复。
1．2．3 ATF6通路
ATF6是Ⅱ型膜蛋白，哺乳动物细胞具有两种亚型，即ATF6α(90 ku)和ATF6β(110ku)，二者结构相似。C端位于ER腔内，具有多个BiP结合位点和两个高尔基体定位信号(Golgi localization signal，GLS)。非ERS时，ATF6和RiP形成稳定的复合物，通过BiP对GLS的抑制作用而停留在ER上。ATF6α和ATF6β在UPR过程中通过相同的机制活化，ER腔内未折叠蛋白堆积信息能够使BiP和ATF6分离，RiP对GLS抑制作用的解除导致ATF6转移到高尔基体，由高尔基体蛋白酶对其跨膜片段进行切割，产生游离的50ku N端片段，该过程类似于固醇反应元件结合蛋白(SREBP)的切割活化。活化的ATF6 N端切割段可转移到核内促进含ERS元件的转录因子(如XBP1)及UPR靶分子(如BiP)等基因转录，ATF6α和XBP1在功能上有所重叠，而ATF6β在UPR过程中并不起重要作用。此3条信号转导通路中，PERK和ATF6通路是高等真核细胞所具有，而IRE-1通路则是在所有真核细胞中普遍存在的。
2 ERS中期整合应激反应(ISR)
蛋白质合成的暂停减轻了新生蛋白肽链对ER的负荷与压力，但这种抑制过程毕竟是一种临时性防御措施。事实上ER经较长时间应激暴露后，ERS蛋白如GRP78、GRP94以及GADD34(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 34)、CHOP(C/EBP-homologous protein，or growtharrest and DNA-damage-inducible gene 153，GADD153)、ATF4等表达增加，这样可提高ERS细胞处理未折叠蛋白或抵御其他细胞应激的能力。磷酸化eIF2α蛋白与早期蛋白质合成暂停有关，但研究发现磷酸化eIF2α蛋白同样与ERS中期应激蛋白的表达与蛋白质合成启动的恢复也有关系。可见磷酸化eIF2α蛋白整合了包括ERS中期蛋白质合成中断的恢复与应激蛋白的表达等所有后续反应，这类反应总称为整合应激。GADD34基因是许多细胞应激因素都能调控表达的一个基因，它编码蛋白磷酸化酶Ⅰ复合体中的一个调节亚基。实验证明GADDM具有使磷酸化eIF2α蛋白脱磷酸，即恢复蛋白质翻译启动的作用。ERS时BiP/GRP78和GRP94以及ATF4，CHOP，GADD34等表达增加的机制不能用GADD34介导的蛋白质合成中断恢复模型加以解释。研究发现，ATF4与GADD34等mRNA在细胞浆中本身大量存在，但是ATF4与GADD34等mRNA序列5’端存在特殊的上游开放阅读框架结构使得ATF4和GADD34通常总是处于翻译抑制状态。当出现ERS时，细胞浆中磷酸化eIF2α蛋白或IRE-1会激活ATF4和GADD34的mRNA上游阅读框架结构，表达相应的蛋白质，但是激活的这些特殊结构mRNA如何在蛋白质合成普遍性抑制下进行翻译的分子机制目前还不十分清楚。
3 ERS后期引起ER性细胞凋亡的发生
ERS细胞随着整合应激反应的进一步演进，一方面积极调动应激反应蛋白以抵御应激诱因所造成的有害影响。同时调整ER功能以适应新的内环境变化，另一方面也会表达一些有可能导致细胞死亡的应激蛋白调节基因如CHOP等，根据情况决定清除那些根本无法恢复到正常功能状态的ERS细胞，ERS引起细胞死亡，通过细胞凋亡作用来摧毁这些受损的细胞。ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路，称为内质网相关性死亡(ERAD)途径。该途径包含ERS诱导CHOP/GADD153蛋白和JNK，是联系ERS与细胞凋亡的重要中间信号分子。
3．1 CHOP/GADD153表达
CHOP是ERS特异的转录因子。其基因启动子上具有氨基酸应答元件(amino acidresponse elemenl，AARE)，氨基酸剥夺或ERS等调节CHOP蛋白表达。CHOP蛋白或与C/EBP或与Jun/Fos家族蛋白成员形成杂二聚体，调节下游凋亡相关基因的表达。CHOP是由抗凋亡向促凋亡转换的重要信号分子，在非应激状态下，它的表达水平很低，而在ERS中，其表达量大大增加，PERK、ATF6、IRE-1都能诱导CHOP的转录。PERK通路的激活在早期通过抑制蛋白质的合成对细胞起保护作用，促进细胞的生存，随ERS的延长，PERK通过诱导CHOP的表达促进细胞凋亡。
3．2 c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化
应激条件下活化的IRE-1可以结合JNK的结合器蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，从而激活JNK，JNK能对其底物c-Jun等转录因子氨基末端进行磷酸化修饰、激活这些转录因子和细胞凋亡信号激酶1(ASK1)，共同激活线粒体依赖的细胞凋亡过程，以调节下游基因的表达。
3．3 Caspase是执行细胞凋亡作用的终末分子
Caspase是执行细胞凋亡的水解酶。目前发现该家族共14个成员，各自作用不同，但彼此间形成级联反应系统，其中caspase-9居该凋亡信号系统中的枢纽位置，caspase-3负责拆卸细胞，capase-12仅产生于ER，并仅在ER内活化蛋白水解。如果caspase-12酶活性升高，可从ER转运到胞浆，在胞浆激活caspase-9和caspase-3等，之后引发细胞凋亡。通常蛋白伴侣BiP与caspase-7和caspase-12形成复合体，细胞不会表现凋亡，但是ERS时BiP减少，无法与caspase-7、caspase-12充分结合，诱发细胞凋亡。说明caspase-12暴露活化也可引起细胞凋亡。
4相关临床疾病与展望
近年有学者报道，2型糖尿病的一个特征是胰岛有淀粉样蛋白沉积(主要是胰淀粉样多肽)，且淀粉样蛋白沉积与β细胞减少正相关。因此，有学者认为淀粉样蛋白沉积引发ERS可能促进了β细胞凋亡，参与了2型糖尿病的发生。研究人类Wolfram综合征(糖尿病-尿崩症-视神经萎缩-神经性耳聋综合征)发现，其糖尿病的发生与WFS1基因突变、功能缺失有关。该基因突变导致其编码产物ER固有蛋白wolframin缺失，使ER降解错误，折叠蛋白质功能降低，引发持久的ERS，导致β细胞凋亡而参与糖尿病的发生。阿尔兹海默病是一种常见的神经系统疾病，病理特征是β-淀粉样蛋白质的沉积，神经原纤维变性和神经元死亡。有研究显示，家族阿尔兹海默病与淀粉样蛋白质前体基因、早老因子-1(presenil-1，PS1)基因、早老因子-2基因的突变有关。PS1是主要存在于ER的跨膜蛋白质，PSI基因的突变使细胞对各种损害诱导的细胞损伤的易感性增加。关于ERS信号通路的知识还并不完善，仍需要发现已知ERS信号转导蛋白的新底物和未知的ERS信号转导。而且，已知一系列环境因素和遗传因素导致的疾病会引发ERS，有利于进一步地了解多种疾病的发病机制。