李载权周爱儒唐朝枢
【作者单位】：北京大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系
《中国生物化学与分子生物学报》2004年03期
【摘要】：
内质网应激是导致心脑组织缺血梗塞、神经退行性疾病等发生的重要环节。目前发现同型半胱氨酸、氧化应激、钙代谢紊乱等都能引起内质网应激级联反应，表现为蛋白质合成暂停、内质网应激蛋白表达和细胞凋亡等。这些表现包括在未折叠蛋白反应(UPR)、整合应激反应(ISR)和内质网相关性死亡(ERAD)三个相互关联的动态过程中，每一过程的分子机理现已逐步被揭示。作为细胞保护性应对机制的内质网应激体系一旦遭到破坏，细胞将不能合成应有的蛋白质，亦不能发挥正常的生理功能，甚至会出现细胞凋亡。掌握内质网应激过程对进一步理解多种疾病的发生机理有十分重要的理论意义。
内质网是哺乳细胞中一种重要的亚细胞器。膜/分泌性蛋白、氨基多糖、磷脂、胆固醇及钙信号等的代谢均与内质网功能直接相关，例如分泌性蛋白的合成与空间折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质分泌等均在内质网内发生。目前研究认为，胰腺细胞、心肌细胞、神经元细胞等内质网功能障碍可能分别是糖尿病、心脑组织缺血梗塞、退行性神经疾病等发生的重要原因。
内质网应激(endoptasmic reticulum stress，ERS)是指由于某种原因使得细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程，如蛋白质不能正确折叠。同样，内质网中某一生理功能发生障碍如内质网内钙流失或钙超负荷，蛋白质糖基化形成障碍或蛋白质不能形成正常的二硫键等也可反过来诱发内质网应激，一般是用未折叠蛋白来提示内质网发生了应激反应。正常情况下，内质网内环境的稳定是实现内质网功能的基本条件，因此内质网具有很强的内稳态体系。尽管如此，但仍然有很多因素可导致内质网功能的内稳态失衡，形成内质网应激。例如缺血再灌注损伤、氧化应激、同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等化学物质处理、细胞内蛋白质合成过快以至于超过蛋白折叠能力、内质网钙代谢紊乱、卵磷脂合成障碍等多种物理、化学或遗传因素等都可成为内质网应激的重要诱因。此外，氨基酸剥夺、砷中毒、热休克等细胞应激和线粒体钙超载都与内质网应激有十分密切的联系，这些纵横交错的关系共同组成了复杂的细胞内应激网络体系。
1内质网应激早期蛋白质合成暂停
内质网应激引起内质网功能紊乱，包括内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的堆积等，其中由蛋白质堆积所引起的一系列后续反应称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。未折叠蛋白反应先表现为蛋白质合成暂停，随着应激反应蛋白基因表达，可进一步改善细胞生理状态。但当应激原强度超过细胞自身处理能力时，内质网也会诱导的内质网性细胞凋亡通路，以消除受损又不能及时修复的细胞，可见细胞内有一套完整的监测、应对内质网应激的体系，因此，所有内质网的应激反应实际上是一种细胞水平上的保护性手段(见Fig．1)。
1983年Brostrom发现，将钙离子添补到预先剥夺钙离子的细胞培养基中再次培养该细胞时，细胞内蛋白质合成速度比补加钙离子前明显增加，起初他们认为蛋白质合成可能是一需胞浆钙离子参与的过程，随后他们加入一种能促进内质网钙离子向胞浆转运的工具试剂thapsigargin(TG，内质网钙泵Ca2+，Mg2+-ATPase抑制剂，现常用来制备内质网因钙丢失而形成内质网应激的一种工具试剂)以增加胞浆中钙水平，结果TG的加入虽增加了胞浆内钙离子水平但并未发现因此而能促进细胞内蛋白质的合成，相反与钙离子剥夺培养基中的细胞一样蛋白质合成仍然受到抑制；Brostrom等在对钙通道蛋白载体表达细胞进行研究时，发现钙离子能从胞浆重新复回到内质网，内质网钙浓度维持稳定，因此细胞内蛋白质合成抑制现象得到明显改善，内质网应激时蛋白质合成暂停发生十分迅速，是一数分钟内即完成的早期事件。同样，以能造成内质网功能障碍但并不影响胞浆钙水平的其它工具试剂如DTY(二硫苏糖醇，能干扰内质网内新生蛋白质二硫键的形成)和tunicamycin(能阻碍内质网内新生蛋白质糖基化修饰)等进行实验。结果发现，所孵育的细胞中蛋白质合成受到抑制，这些现象归纳提示内质网内稳态失衡可能是导致蛋白质翻译暂停的直接原因。
参与真核细胞蛋白质翻译起始复合体eIF2(eukaryotic translation initiation factor 2)蛋白有α、β、γ三种亚基，其中eIF2α51位丝氨酸可被磷酸化修饰。正常情况下，eIF2α蛋白以GTP结合型征募(recruit)起始蛋氨酰tRNA到小亚基核蛋白体，形成小亚基核蛋白复合体，后者识别与结合模板mRNA，再装配成具有蛋白质合成功能的核蛋白复合体。随后GTP被降解，释放GDP结合型eIF2蛋白。只有当GDP结合型eIF2蛋白经eIF2β作用重新转换成GTP结合型eIF2蛋白时才能参与下一轮核蛋白复合体组装与启动工作，但是eIF2α蛋白51位丝氨酸发生磷酸化修饰后eIF2β就不能促进其GTP-GDP交换，因此，eIF2不能再被重复利用，从而抑制蛋白质合成的启动过程。现在发现内质网应激、酵母细胞氨基酸饥饿、哺乳类动物细胞血红素短缺、双链RNA病毒感染均能通过eIF2α磷酸化途径使蛋白质合成受到抑制，其中促进磷酸化修饰的特异性蛋白激酶分别是PERK(PKR-like ER kinase，PERK)、GCN2(general control non-derepressible-2)、HRI(hemereticulocytes inhibitor)和PKR(double strandRNA-dependent protein kinase)。
PERK属Ⅰ型内质网跨膜蛋白，胞浆侧羧基端的蛋白激酶活性既可使eIF2α磷酸化，又可使自身磷酸化，是PERK的主要功能区；而游离于内质网内的氨基端蛋白主要是感受内质网的应激信息。TG介导的内质网应激实验证实了细胞内eIF2α磷酸化与蛋白质翻译停止，蛋白质免疫印迹实验进一步发现PERK电泳条带迁移率较未经应激处理组降低，降低的PERK电泳条带经碱性磷酸酶处理后迁移率恢复正常，说明PERK发生了磷酸化修饰；体外实验证明，该PERK条带的磷酸化来自PERK自身的催化活性，而不是其他激酶作用的结果；只有磷酸化的PERK才能使eIF2α蛋白51位丝氨酸磷酸化，经PERK作用使位于内质网外侧eIF2α蛋白磷酸化可能是内质网应激时蛋白质合成抑制的重要原因。近来从人类胰腺细胞中发现有一种与PERK同源的蛋白PEK(pancmatic eIF2αkinase，PEK)也可对eIF2α磷酸化，对蛋白质的翻译启动同样有抑制作用。
PERK蛋白感受内质网内应激的过程可能与免疫球蛋白结合蛋白BiP(immunoglobulin binding protein，orglucose regulating protein78，又称为BiP/GRP78)的游离有关．内质网应激时大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白质发生堆积，原来大量存在的而且主要与PERK结合的BiP转而去应付未折叠蛋白，从而使PERK暴露、PERK间相互聚合、促进磷酸化发生，PERK自身激活并催化底物eIF2α蛋白发生磷酸化。Yamamoto研究发现高尔基体KDEL受体(一种帮助从高尔基体返回内质网的BiP运载蛋白受体)缺失时细胞内质网内因BiP大量丢失导致了蛋白质的合成抑制，提示蛋白质合成抑制可能与PERK充分暴露而被激活有关。
综上认为，内质网应激时与PERK结合的BiP由于应付大量的未折叠蛋白质而使得内质网内PERK蛋白暴露，发生自身磷酸化与二聚化，活化的PERK蛋白进一步使内质网外侧的eIF2α发生磷酸化修饰，磷酸化修饰的eIF2α不受eIF2β的GTP-GDP的交换作用，使得蛋白质合成启动过程暂停。
2内质网应激中期整合应激反应的出现
大多数内质网应激时PERK因BiP参与未折叠蛋白的结合而被游离出来、PERK间聚合、然后激活下游eIF2α磷酸化，反馈抑制蛋白质合成的起始过程。蛋白质合成的暂停减轻了新生蛋白肽链对内质网蛋白质折叠需求的负荷与压力，但这种抑制过程毕竟是一种临时性防御措施。事实上内质网经较长时间应激暴露后，内质网应激蛋白如GRP78、GRP94以及GADD34(growtharrest and DNA-damage-inducible gene 34)、CHOP(C/EBP-homologousprotein，or growth arrest and DNA-damage-inducible gene153，GADD153)、ATF4(activatingtranscription factor-4)等表达增加，这样可提高内质网应激细胞处理未折叠蛋白或抵御其它细胞应激的能力。磷酸化eIF2α蛋白与早期蛋白质合成暂停有关，但研究发现磷酸化eIF2α蛋白同样与内质网应激中期应激蛋白的表达与蛋白质合成启动的恢复也有关系，可见磷酸化eIF2α蛋白整合了包括内质网应激中期蛋白质合成中断的恢复与应激蛋白的表达等所有后续反应，这类反应总称为整合应激反应(integrated stress response，ISR)，这种整合反应一般需1～2h才能完成。
整合应激反应中蛋白质合成中断的恢复与磷酸化eIF2α蛋白脱磷酸作用有关。GADD34基因是许多细胞应激因素都能调控表达的一个基因，它编码蛋白磷酸化酶Ⅰ复合体中的一个调节亚基，实验证明GADD34具有使磷酸化eIF2α蛋白脱磷酸，即恢复蛋白质翻译启动的作用，例如TG较长时间处理eIF2α-/-型或PERK-/-型细胞，然后提取细胞内质网，用免疫印迹法检测，结果均未能检测到GADD34蛋白．而野生型细胞经TG处理后GADD34表达，说明GADD34蛋白是磷酸化eIF2α蛋白诱导表达的结果。Koiim等在GDD34基因水平将去磷酸化作用碱基序列删除，建立转基因小鼠GADD34aΔC/ΔC，然后以TG喂养GADD34ΔC/ΔC小鼠．结果发现细胞内eIF2α蛋白一直保持磷酸化状态，蛋白质合成一直保持停止状态，小鼠死亡率增加，而野生型小鼠eIF2α蛋白经历短暂磷酸化后，迅速去掉磷酸根，同时蛋白质合成经历约0．5～2h短暂的抑制后迅即回升。由此可见，GADD34参与了磷酸化eIF2α蛋白的去磷酸化作用，而且能使蛋白质的合成中断得以恢复。
显然GADD34基因的表达是整合应激反应中蛋白质合成中断后重新恢复的重要环节，除GADD34蛋白表达外还有不少其它的内质网应激蛋白在内质网应激反应中期高表达。实验研究发现TG处理野生型细胞时BiP/GRP78和GRP94高表达，但是TG处理GADD34ΔC/ΔC转基因小鼠时GRP78和GRP94反而低表达；转基因eIF2α-S52A细胞(该细胞eIF2α蛋白51位上不能被磷酸化)较相应野生细胞经TG较长时间作用后GRP78与GADD34表达也明显减少，这些事实说明磷酸化eIF2α蛋白可能直接与应激蛋白高表达有关。因此，在内质网应激反应中期，由磷酸化eIF2α蛋白统一整合了包括调控内质网应激蛋白的表达与蛋白质合成启动暂停的重新开始等在内的所有后续应激反应。
内质网应激时BiP/GRP78和GRP94以及ATF4、CHOP、GADD34等表达增加的机制是不能用GADD34介导的蛋白质合成中断恢复模型加以解释，因为表达增加的GADD34蛋白促进了磷酸化eIF2α蛋白的去磷酸化作用，进而使蛋白质合成中断恢复的。研究发现，ATF4与GADD34等mRNA在细胞浆中本身大量存在，但是ATF4与GADD34等mRNA序列5’端存在特殊的上游开放阅读框架(upstream open readingframes，uORFs)结构使得ATF4和GADD34通常总是处于翻译抑制状态，当出现内质网应激时，细胞浆中磷酸化eIF2α蛋白或IRE1(内质网应激时一种参与RNA变位剪接和eIF2蛋白磷酸化的双功能酶)会激活ATF4和GADD34的mRNA上游阅读框架结构，表达ATF4和GADD34蛋白。但是激活的这些特殊结构mRNA如何在蛋白质合成普遍性抑制下进行翻译的分子机理目前还不十分清楚，推测细胞内可能预先存有微量GADD34作为“种子”，通过“种子”引导的eIF2α蛋白去磷酸化作用和mRNA分子中具有uORF结构的内质网应激蛋白优先表达，使内质网的应激蛋白得到表达。
3内质网应激后期引起内质网性细胞凋亡的发生
内质网应激细胞随着整合应激反应的进一步演进，细胞一方面积极调动应激反应蛋白以抵御应激诱因所造成的有害影响，同时调整内质网功能以适应新的内环境变化要求，另一方面也会表达一些有可能导致细胞死亡的应激蛋白调节基因如CHOP等，根据情况决定后面清除那些根本无法恢复到正常功能状态的内质网应激细胞。内质网应激引起细胞死亡，通过细胞凋亡作用来摧毁这些受损的细胞可能是解决内质网应激受损细胞不得已的措施。
线粒体细胞凋亡过程先是促进细胞内凋亡蛋白如P53、Bax、Par-4的表达活化，这些凋亡蛋白促进线粒体膜通透性增加，释放细胞色素c，后者再活化蛋白水解酶caspase-3等，引起细胞凋亡解体。内质网应激引起的细胞凋亡不同于线粒体细胞凋亡，有一套自身的信号传递通路，称为内质网相关性死亡(ER-associated death，ERAD)途径。READ途径包含内质网应激诱导CHOP/GADD153表达、JNK(c-Jun NH2-terminal kinases，JNK)的活化和/或caspase-12蛋白水解酶的活化。
CHOP/GADD153蛋白与JNK是联系内质网应激与细胞凋亡的重要中间信号分子，caspase蛋白水解酶是执行细胞凋亡作用的终末分子。CHOP基因启动子上具有氨基酸应答元件(amino acid responseelement，AARE)，氨基酸剥夺或内质网应激等许多因素分别通过AARE或其他相关元件来调节CHOP蛋白表达，CHOP蛋白或与C/EBP或与Jun/Fos家族蛋白成员形成杂二聚体，调节下游凋亡相关基因的表达。实验证明TG长时间作用细胞时CHOP大量表达且进一步导致细胞生长停滞和细胞死亡，在删除CHOP蛋白转录调控区的转基因细胞中加入TG后长时间作用发现细胞凋亡反而明显减弱，表明CHOP介导了TG内质网应激时的细胞凋亡过程。JNK能对底物c-JUN或AFT2等转录因子氨基末端进行磷酸化修饰、激活这些转录因子以调节下游基因的表达。实验表明同型半胱氨酸(HCY)剂量依赖性引起内皮细胞的内质网应激与细胞凋亡，其中IRE1-JNK-ATF3途径参与了细胞凋亡的激活过程。Caspase蛋白水解酶(半胱氨酸天冬氨酸酶简称)属白介素1β转换酶(interleukin-1beta converting enzyme，ICE)家族，是执行细胞凋亡的水解酶。目前发现该家族共14个成员，各自作用不同，但彼此间形成级联反应系统，其中caspase-9居这个凋亡信号系统中的枢纽位置，caspase-3负责拆卸细胞等，capase-12仅产生于内质网，并仅在内质网内活化蛋白水解酶．TG处理细胞时内质网caspase-12酶活性升高，然后caspase-12从内质网转运到胞浆，在胞浆激活caspase-9和caspase-3等，之后引发细胞凋亡。通常伴侣蛋白BiP与caspase-7和caspase-12形成复合体，细胞不会表现凋亡，但是内质网应激时BiP减少可以诱发细胞凋亡，说明caspase-12暴露活化也可引起细胞凋亡。
目前内质网应激引起细胞凋亡的基础研究仍在不断发展，原认为凋亡分子Bax和Bak仅存在于线粒体外膜，现发现同样存在于内质网外膜上；TG可分别刺激内质网与线粒体上Bax和Bak蛋白引起构象变化与二聚化，无论是经内质网或线粒体引起的Bax和Bak蛋白活化均可介导细胞凋亡，但是引起细胞凋亡的途径不完全相同，如经内质网Bax分子仅引起内质网的caspase-12和钙离子所参与的细胞凋亡过程；经线粒体Bax介导的细胞凋亡主要由caspase-7和PARP分子参加的凋亡过程，提示内质网应激性细胞凋亡可能是与线粒体性细胞凋亡不同的细胞信号传导途径。
4临床疾病的研究与展望
家族性帕金森氏病患者神经细胞中存在帕金蛋白(parkin)的突变体形式。parkin蛋白本身具有泛素连接酶E3(E3 ubiquitin ligase)功能，能促进神经元细胞中神经毒性蛋白如长链多聚谷氨酰胺蛋白(anexpanded polyglutamine protein)的降解，但是帕金森氏病患者Parkin突变体没有泛素连接酶E3的作用，因此不能及时清除神经细胞中神经毒性蛋白，内质网神经毒性蛋白堆积发生应激，长期内质网应激进一步加重神经细胞的凋亡，这可能是帕金森氏病发生的一个重要环节。
我们在小鼠腹腔注射HCY复制的高同型半胱氨酸血症模型上测定了小鼠组织金属硫蛋白(metallothionein，MT)含量的变化．结果发现，HCY能通过氧化应激作用诱导MT生成，金属硫蛋白与伴侣蛋白GRP78同样是抗氧化应激的重要细胞保护分子。高同型半胱氨酸是强烈的内质网应激原，早期能刺激细胞外基质中超氧化物歧化酶表达，晚期刺激GRP78表达，我们推测高同型半胱氨酸刺激金属硫蛋白表达可能是细胞内质网应激蛋白表达的一部分，血管平滑肌细胞受到氧化应激也会有内质网应激进而对细胞增殖产生影响。
Shibata在小鼠中脑动脉血管暂时性梗塞模型中发现，1 h梗塞后缺血再灌注时Bip/GRP78表达增加，5 h梗塞后缺血再灌注则caspase-12表达增加，免疫印迹实验发现神经组织细胞凋亡TUNEL阳性与caspase-12阳性共存，证明内质网应激后由caspase-12引起了神经细胞凋亡。Hayashi在下丘脑缺血灌注预处理(preconditioning)后第2天大鼠脑组织中发现伴侣蛋白GRP78表达增加，PERK磷酸化延迟，神经细胞死亡降低，提示缺血灌注预处理的细胞保护可能与内质网应激有关。
新研究还表明，内质网应激是线粒体应激发生发展的始动环节，因此有必要重新评价心脑血管病、老年痴呆、糖尿病等多种疾病发生的线粒体应激机理。同样内质网应激作为重要而基本的细胞保护手段，因此针对内质网应激环节对这些疾病治疗方案的全新设计将会有进一步的发展。