凌今，凌人，黄彬彬，叶炜剑，丛维涛，金利泰
中国医药生物技术2013年4月第8卷第2期
作者单位：325035，温州医学院药学院蛋白质组学中心(凌今、黄彬彬、叶炜剑、丛维涛、金利泰)；
321000浙江金华广福医院病理科(凌人)；
321000浙江金华市人民医院药剂科(凌今)
收稿日期：2012-11-30
短暂的缺血会对器官造成损伤，但是在恢复灌注后，损伤反而进一步加剧，这种现象称为缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)。临床上涉及缺氧/复氧过程的手术都不可避免地会发生IRI，比如重大器官的移植、冠脉搭桥、溶栓术等。IRI一直是医学研究的热点，近年来研究发现，缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)时，钙超载、供能不足和氧自由基的大量产生等理化因素刺激细胞，诱发信号介导的细胞损伤、凋亡是造成IRI的一个重要原因。本文就IRI与信号通路的研究进展做简要综述。
1缺血再灌注损伤
缺血时器官以无氧酵解方式呼吸供能，胞内累积大量乳酸，pH下降。再灌注时，细胞为了恢复正常的pH水平，泵入Na+以交换H+，但Na+过量引发了Ca2+内流，迅速升高的Ca2+造成细胞钙超载，导致死亡。过量生产的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)在IRI的发生发展中起着至关重要的推动作用，即使在临床手术时应用抗氧剂，其损伤往往也难以有效遏制。缺血发生时，细胞降低代谢水平来适应供能供氧不足的情况，再灌注时，细胞代谢水平迅速恢复正常，但氧化供能短时间无法满足其需求，这也是造成细胞损伤的又一原因。功能细胞是器官的关键组成，代谢非常活跃，因而易受到致命的影响。功能细胞的大量死亡宏观表现为器官的功能障碍，暂时或长久性的功能障碍即缺血再灌注损伤。
2细胞信号转导
生物体是由一群具有特殊结构与功能的细胞并由细胞膜组成的复杂有机体，其内的大分子、细胞器、细胞、组织和器官在空间上是相互隔离的，且大多数细胞不与外界环境直接接触，因此多细胞生物对外界的刺激(包括物理、化学、生物因素)需要细胞间复杂的信号转导系统通过级联系统传递，从而调控机体内功能各异细胞的新陈代谢和行为，以保证整体生命活动的正常进行。可以说，所有重要的生命现象都与细胞内信号转导有关。细胞信号转导通常是指细胞通过细胞表面受体接受外界信号，通过系统级联传递机制，将细胞外信号转导为胞内信号，引起细胞生理反应或诱导特定基因的表达，引起细胞的应答反应。病理状态下，细胞的信号转导发生改变，其中一部分级联信号激活自身防御及代偿机制，提高机体对疾病的抗性；另一部分信号则诱发细胞代谢紊乱，介导细胞凋亡，促进疾病的发生发展。因此，探究疾病状态下信号转导变化，可以为临床治疗开辟一条崭新的道路。
3缺血再灌注的病理生理学特点
在病理条件下，冠脉闭塞15～20 s，糖酵解随即成为高能磷酸化供能的仅有方式。虽然短时间内可以维持心肌细胞的基础能量需求，但是当缺血时间延长至60～90 min时，提供ATP的无氧酵解过程基本停滞，细胞几无能量供应，梗死面积逐步扩大，心脏挛缩。
再灌注时，心脏的能量需求恢复，然而功能的恢复却相对滞后，缓慢地达到缺血前的状态，这个现象被称为心肌钝抑。钝抑的心肌往往消耗大，做功少，效率低下。这主要是因为在再灌注时脂肪酸氧化、糖酵解和丙酮酸氧化速率大幅升高。高速率的脂肪酸β氧化很大地抑制了葡萄糖氧化，致使葡萄糖氧化和糖酵解水平失衡。血浆内的高浓度游离脂肪酸可进一步抑制丙酮酸的氧化。如果糖酵解与葡萄糖氧化偶联，那么糖酵解不产生H+。然而如果糖酵解不与葡萄糖氧化偶联，丙酮酸则酵解生成乳酸，这个过程中由于ATP的水解，每个葡萄糖分子净生成2个H+。这种葡萄糖氧化和酵解的解耦合作用是心脏内H+的主要来源。代偿供能产生的H+蓄积于细胞内，再灌注时细胞会把Na+泵入胞内，置换出H+，从而恢复pH值到正常水平。Na+的大量流入刺激了细胞内的Na+与细胞外的进行Ca2+交换，Na+/Ca2+的交换效率很高，细胞内Ca2+很快出现超载现象，导致了细胞的死亡。
基于上述细胞代谢的研究发现，线粒体膜上非选择性的通道——线粒体通透性转换孔(mPTP)是再灌注损伤的决定性因素。再灌注期间，线粒体通透性决定了细胞存亡：如果通透性较小，细胞可能恢复；通透性中等，细胞发生凋亡；通透性大，细胞则因为能量供应不足而坏死。在心肌缺血期间mPTP是关闭的，仅在再灌注的前几分钟开启，以适应线粒体钙超载、氧化应激、pH的恢复以及ATP耗竭。这个通道的开放破坏了线粒体膜电位，阻断了氧化磷酸化，导致了ATP的耗竭，细胞死亡。
此外，细胞内诸如H+、Ca2+量的改变破坏了线粒体膜电位，导致了活性氧自由基的产生。活性氧会直接损伤DNA、蛋白质、脂类，这种非特异性的损伤经过细胞因子介导，生成肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α过表达的TNF-α与心肌细胞上的肿瘤坏死因子受体结合，引起心脏收缩功能障碍、心肌肥大、纤维化和细胞死亡。胞内过量的Ca2+与焦磷酸形成复合物，同时产生尿酸，磷酸钙和尿酸被称为“危险信号”，都是强炎症刺激物。炎症刺激物包括现有炎性分子的增多以及白细胞介素-1β(interleukin1β，IL-1β)的分泌等。这些炎性物质刺激Toll样受体(TLRs)进而通过激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)促进炎性细胞因子和趋化因子产生。在再灌注的起初6 h，梗死区域内中性粒细胞趋化因子释放，并在未来24h迁移到心肌组织。此过程促进中性粒细胞黏附，引起血管堵塞，并释放降解酶和更多的ROS。正如上文所述，这些代谢变化又直接影响组织的炎症和完整性，甚至细胞的存活。
4缺血再灌注损伤与信号通路
4．1 Toll样受体4信号通路
Toll样受体4(Toil-likereceptor 4，TLR-4)是1997年Rock等初次发现的一种类果蝇源的Toll样受体，在人体内分布较为广泛。TLR-4介导的信号通路包括髓样细胞分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88)依赖性途径和MyD88非依赖性途径。MyD88依赖性途径是通过其与TLR-4相互作用，经TIR区域向细胞内传递信号，活化NF-κB进入细胞核，诱导一系列特定基因的表达，引起多种炎性细胞因子的释放，造成细胞损伤。
Wang等采用BALB/c小鼠和TLR-4先天性缺损小鼠(C3H/HeJ)研究肝脏IRI。实验发现，C3H/HeJ组小鼠肝功能损伤程度、血清TNF-α水平显著低于对照组，提示TLR-4受体激活，可增加TNF-α参与肝脏IRI损伤。Zhai等进一步研究发现，TLR-4敲除对小鼠肝脏IRI有保护作用，而TLR-2敲除无此作用。Oyama等在小鼠心肌IR模型中发现，TLR-4缺陷型小鼠(C57/BL10ScCr)心肌中多形核白细胞(polymorphonuclear，PMN)浸润显著减少，炎症反应减轻，心肌梗死面积较小。Chong等采用C3H/HeJ(TLR-4基因缺失)小鼠复制了心肌IRI实验，验证了TLR-4介导心肌IRI损伤的结论。Wu等在研究肾脏IRI时发现，缺血后肾小管上皮细胞存在TLR-4表达和PMN浸润，而TLR-4缺陷型小鼠在IR后肾功能和肾实质损伤明显减轻。同时，在MyD88缺陷型小鼠身上观察到和TLR-4缺陷型小鼠一样的保护作用，说明TLR-4通过MyD88依赖性信号通路介导IRI。后来，Hua等研究发现，TLR-4缺失型小鼠保护心肌IRI的作用可被磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(phoshatidylinositol-3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K/Akt)抑制剂消除，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉，TLR-4-/-小鼠抗心肌IRI是通过PI3K/Akt信号转导通路实现的。
4．2缺氧诱导因子信号通路
细胞感知氧水平改变，供氧不足时改变细胞生理状态，通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducibletranscription factor，HIF)氧敏感性转录通路，结合缺氧调控元件(HRE)，调控多种基因表达，提高细胞对缺氧的适应性。同时，HIF在IRI中也表现为一种有益因子。Nataraian等通过siRNA干扰小鼠微血管内皮细胞PHDs表达来增加HIF的表达，发现iNOS表达也随之增加，IR后，梗死面积显著减少。然而，iNOS基因敲除的小鼠无抗IRI的作用。Xi等在体外模型中应用氯化钴激动HIF，发现能减少梗死面积，而在iNOS敲除的小鼠器官中则没有观察到保护作用。这些研究表明，在IRI中，HIF可以上调iNOS消除IR产生的ROS发挥保护作用。
Pachori等用RNA技术诱导大鼠血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)过表达，观察到HO-1过表达的大鼠心脏、肝脏等器官在发生IR时损伤减轻，这是由于HO-1及其催化产生的血胆红素、CO均具有抗氧化应激损伤的作用。HO-1催化氧化需消耗大量氧分子，竞争了氧自由基的氧来源，减少氧自由基的产生。胆红素能清除活性氧，在多种疾病中发挥抗氧化作用，而CO在一定范围内可减少ROS的生成。再灌注时HIF上调，诱导HO-1表达增加，通过上述途径发挥抗氧化作用，减轻器官的再灌注损伤，这可能是HIF抗IRI的又一途径。
4．3促分裂素原活化蛋白激酶途径
促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)途径是介导细胞反应的重要信号系统，参与了细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步等多种生理反应的过程。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，由多种同工酶组成，主要包括细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38MAPK。
4．3．1 ERK信号通路
ERK被认为是经典的MAPK信号通路途径。研究发现，ERK在正常细胞中低表达，而受到IR的刺激后，pERK显著上调。对于IR刺激下ERK通路的激活，是发挥保护作用还是介导凋亡，学术界尚无定论。
部分学者认为ERK通路激活在IRI中发挥保护作用。Tao等研究发现，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，SIP)通过激活ERK促进成年小鼠心肌细胞在IR模型中的存活。Yue等和Das等报道激活ERK通路可减少IR诱发的细胞凋亡，宏观上缩小心肌梗死的面积。ERK通路可能通过如下几个方面发挥保护作用：
①ERK促进B细胞淋巴瘤基因2(B-celllymphoma gene 2，Bcl-2)表达，拮抗凋亡蛋白Bax表达，减少caspases-3活化；
②Bcl-2与c-myc共同阻止p53入核及其诱导细胞凋亡作用；
③ERK激活核糖体S6蛋白激酶(RSK)可使环腺苷酸应答元件结合蛋白(cAMP)磷酸化，协同抑制细胞凋亡，促进细胞存活；
④ERK激活可提高ATP水平，恢复供能；
⑤可拮抗JNK，p38信号通路的促凋亡作用。
另外一部分学者则持相反观点。Stanciu等、Tsoporis等和Tong等在各自的研究中发现，激活ERK通路会导致培养的细胞的IRI加重。更多的研究分析ERK可能通过以下途径介导损伤：
①ERK是p53的上游信号分子，pERK可激活p53磷酸化，介导细胞凋亡；
②ERK激活后通过ERK1/2/Elk/Egr-1通路上调Egr-1蛋白，介导IR损伤；
③ERK激活miR-1和miR-206抑制Hsp60表达，削弱Hsp60保护作用，加重器官IRI；
④ERK激活可导致活性氧(ROS)产生增加，引起IRI。
ERKs作为MAPKs中经典通路，参与了细胞生理、病理过程。不同的实验发现ERK在IR中扮演了截然相反的角色，这可能与IRI进程有关。IRI早期，ERK的激活可启动内源性的保护机制，而在IRI中晚期则以介导细胞损伤为主。
4．3．2 JNK通路
JNK位于细胞质中，当IR刺激激活JNK发生磷酸化时，pJNK转入细胞核中参与细胞增殖、代谢、凋亡等调控。Ferrandi等在大鼠心肌IR模型中应用AS601245(JNK选择性抑制剂)可以减少细胞凋亡和梗死面积。Okuno等研究发现，脑缺血区的pJNK水平增高，应用JNK抑制剂SP600125可以阻止Bax从胞质转入胞核，抑制神经元的凋亡。Carboni等应用抑制剂AS601245处理小鼠神经细胞可有效减轻IRI。大量实验发现，IR发生时，JNK活性显著升高。其抑制剂可降低IR引起的细胞凋亡，提示JNK参与了IRI的进程。
JNK在IRI中介导细胞凋亡主要有两个机制：
①转录因子途径：JNK激活后调控下游因子转录，上调凋亡蛋白表达，介导凋亡途径引起细胞凋亡，如：JNK活化后进入细胞核，启动转录因子和ATF-2、AP-1、Elk-1等，诱发FasL、TNF-2、BH3-only蛋白表达上调，激活凋亡程序；
②非转录因子途径：部分活化的JNK不进入细胞核，不参与转录、调控，而是在细胞质中直接作用于Bcl-2，引起线粒体通透性的改变，诱发细胞凋亡。
4．3．3 p38 MAPK信号通路
p38 MAPK是MAPKs中的又一重要通路。活化的p38在细胞成活、分化、发育、炎症以及应激反应等生理、病理进程中发挥重要作用。IR发生时，释放的氧自由基和细胞因子激活p38 MAPK，将胞外刺激传递到胞内，引起蛋白表达改变，诱发细胞凋亡。研究发现，在再灌注前使用p38 MAPK特异性阻滞剂SB203580、FR167653等可以有效抑制p38MAPK的激活，减少再灌注器官的损伤。p38 MAPK通过以下几个途径介导细胞凋亡：
①上调c-myc表达，c-myc是细胞凋亡的主要诱因；
②促进p53磷酸化；
③参与Fas介导的凋亡；
④激活c-Jun和c-fos；
⑤诱导Bax转位；
⑥激活NF-κB，提高TNF-α等炎性因子表达，诱发细胞炎性损伤。
细胞的炎性损伤和凋亡导致再灌注器官的功能障碍和衰竭。
4．4磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路
Akt是PI3K/Akt通路的核心，也是PI3K下游的直接作用靶点。许多细胞因子、生长因子、理化刺激均可以活化PI3K，从而磷酸化Akt，激活下游级联反应和靶蛋白之间的相互作用。
大量研究表明，在IR发生时，激活PI3K/Akt信号通路可以显著抑制心肌细胞凋亡，缩小梗死面积。Li等发现，胰岛素与受体结合，可激活其受体的酪氨酸激酶，进一步激活PI3K/Akt通路，上调下游靶蛋白p70S6K和eNOS，产生保护心肌的作用。Raphael等应用异氟烷预处理兔体，发现其心脏在IRI中梗死面积和凋亡细胞减少，Westernblot显示pAkt、pBad和Bcl-2上调，而Bax下调，PI3K抑制剂可拮抗该保护作用，提示PI3K/Akt活化后可减少Bad介导的细胞凋亡，参与了异氟烷对IRI的保护作用。马亚飞等研究发现，葛根素预处理亦可对抗心肌IRI，这种保护作用可以被Akt选择性抑制剂LY294002阻断，推测葛根素的保护作用可能也与PI3K/Akt信号通路的激活有关。王岩采用分别给予PI3K、Akt、eNOS抑制剂的方法干预普伐他汀对心肌IRI的保护作用，结果显示PI3K、Akt、eNOS均可特异性拮抗普伐他汀对兔心肌IRI的保护作用，显示普伐他汀通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥作用。
实验观察到不同种类药物发挥IRI保护作用时均激活了PI3K/Akt信号通路，而特异性抑制剂拮抗其保护作用，说明PI3K/Akt通路的激活对心脏起保护作用。更多研究表明，活化Akt能作用于下游eNOS、Bcl-2、GSK-3β、caspase-9、p70S6K等多个靶点，并减少mPTP的开放，稳定线粒体膜，减少促凋亡因子活化，发挥抗凋亡、保护再灌注器官的作用。
5总结与展望
综上所述，HIF作为特异性氧敏感性转导通路在缺血及再灌注2个损伤环节均发挥重要调节作用。MAPKs在IR时激活，ROS与MAPK通路存在交互作用，ROS能诱导MAPK的激活，同时这些激酶亦可反作用调节ROS水平。p38被证实可以调节线粒体内ROS水平，通过Raf/MEK/ERK通路对抗线粒体内过多的ROS和Ca2+，减少细胞凋亡。然而ERK是否起到细胞保护作用仍然未有定论。另一方面，先天免疫和炎症在IRI中已有深入研究，促炎因子和免疫调节因子在IR时表达增加。Toll样受体是这些免疫和炎症诱导物的结合受体，它在炎症诱导的IRI中起核心作用。细胞损伤时释放的高迁移率蛋白(HMGB1)是一种TLRs配体。ROS可通过上调HMGB1，增加其与TLRs结合来激活NF-κB，经NF-κB信号介导在IRI时调节炎症因子的产生。在诸如脑、肺、肝、肾、肠等器官中也观察到了相似的作用。此外，PI3K/Akt的激活可以对抗缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡。心肌缺失TLR-4小鼠的NF-κB结合激活减少以及Akt磷酸化水平增加，不易发生IRI，而使用小分子抑制PI3K可以完全消除TLR-4缺失小鼠的IRI心肌保护作用，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉。
目前，在临床上防治IRI并无特效药物，随着IRI与细胞信号转导研究的不断深入，对IRI发病机制的了解也越发透彻，这为防治IRI新药的研发提供了更多崭新的思路。