作者：夏舒萌张德琛吴小晶于卫江史辛波陈立芳郑戈
作者单位：解放军第四六六医院麻醉科，北京市，100089
期刊：中国临床康复2005，9(2)
摘要：
目的：
观察骨骼肌缺血再灌注后呼吸链电子漏、呼吸控制率、丙二醛和髓过氧化物酶的变化，评价3-硝基-N-甲基水杨酰胺(3-nitro-N-methy solicylamide，NSMA)对肢体缺血再灌注损伤的影响。
方法：
实验于1998-10/2000-05在解放军第三0四医院创伤外科研究室完成，制备缺血再灌注模型.将35只健康Wistar大白鼠，饲养环境清洁，合格证号军医动字第B98008号.随机分为7组(对照组、缺血2 h、缺血2 h再灌注1 h、缺血2 h用NSMA再灌注1 h、缺血6 h、缺血6 h灌注1 h、缺血6 h用NSMA再灌注1 h)，选取不同时点骨骼肌标本，提取骨骼肌线粒体、测定线粒体呼吸控制率、抗氰呼吸、经皮测量动脉氧分压及局部相对血流量、测定骨骼肌丙二醛含量和髓过氧化物酶活性、对骨骼肌线粒体超微结构进行透射电镜检测。
结果：
缺血2 h(1.45±0.10)、缺血2 h再灌注1 h(1.49±0.13)、缺血6 h(0.79±0.08)、缺血6 h灌注1h(1.32±0.07)RCR比对照组(2.82±0.25)、缺血2 h用NSMA再灌注1h(2.93±0.47)、缺血6 h用NSMA再灌注1 h(2.19±0.38)显著下降(P＜0.01)；
缺血2 h用NSMA再灌注1 h组线粒体氧化磷酸化偶联程度与对照组相似，缺血6 h用NSMA再灌注1 h组与相应的缺血2 h、缺血2 h再灌注1 h、缺血6 h、缺血6 h灌注1 h组明显提高；
缺血2 h(3.02±0.24)、缺血2 h再灌注1 h(3.30±0.08)、缺血6 h(3.36±0.22)、缺血6 h灌注1h(3.74±0.21)组抗氰呼吸分别比缺血2 h用NSMA再灌注1 h(0.22±0.05)、缺血6 h用NSMA再灌注1 h(1.46±0.30)组增加(P＜0.01)；
随缺血的时间的延长，丙二醛浓度显著增加(P＜0.01)，髓过氧化物酶的活性显著升高(P＜0.01)，再灌注后丙二醛仍继续增加(P＜0.01)，髓过氧化物酶的活性持续升高(P＜0.01)，相应肢体组织的PO2在阻断期0～1 mm Hg，2 h后再灌注的起初2 min血流量先恢复随即减慢，但在阻断6 h再灌注时血流基本停止，此时被阻断的肢体无痛觉反应；
病理改变在缺血再灌注后更为严重，缺血后预先应用NSMA再灌注骨骼肌大部分线粒体完整。
结论：
伴随着电子漏增加、线粒体活性降低，丙二醛浓度增加和髓过氧化物酶的活性增高与组织的损伤程度呈正相关；
NSMA能影响呼吸链电子传递，使氧自由基减少，进而维持线粒体结构的完整性和线粒体的功能活性，使细胞进行正常的氧化磷酸化，减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。
0引言
既往研究表明，活性氧代谢物是导致组织缺血再灌注损伤的主要原因之一。目前认为缺血再灌注损伤与线粒体功能改变有重要关系。研究其发生机制，有效改善再灌注损伤过程中线粒体功能，是防治缺血性组织损伤的重要环节。本研究探讨3-硝基-N-甲基水杨酰胺(3-nitro-N-methylsalicylamide，NSMA)对缺血再灌注骨骼肌线粒体的影响。
1材料和方法
设计：以实验动物为研究对象，完全随机设计，对照实验研究。
单位：解放军第四六六医院麻醉科。
材料：实验于1998-10/2000-5在解放军第三0四医院创伤外科研究室(系全军烧伤研究所基础部创伤外科研究室)完成。健康Wistar大白鼠35只，由解放军第三零四医院实验动物室提供，体质量180～240g，雌雄不拘。实验动物一等级，饲养环境清洁，合格证号军医动字第B98008号。
随机分为7组，每组5只。7组分别为对照组(按缺血模型制备步骤行手术操作，但不阻断右髂总动脉)；缺血2h；缺血2h后再灌注1h；缺血2h后给药NSMA再灌注1 h；缺血6h；缺血6h后再灌注1h；缺血6h后给NSMA再灌注1h。
试剂：牛血清白蛋白(BSA，无脂肪酸，BM分装)；D-甘露醇(日本分装)；ADP(北京鼎国生物技术发展中心提供)。琥珀酸钠(北京求贤化工厂产品)。实验中所用其他试剂均为分析纯。
仪器：72型光电分光光度计。TOM-1型经皮氧监护仪。
设计、实施、评估者：由第一作者主持设计实验过程，由本文全部作者按实验设计进行干预和评估，经过培训。
方法：
缺血再灌注模型的制备：参考Yokota等的方法制成。以30g/L戊巴比妥钠按25～30mg/kg行腹腔麻醉，1～2h追加1/3药量维持麻醉。剃毛、消毒后沿腹白线开腹，在近髂总动脉处，以无创伤动脉夹夹闭右髂总动脉，制成右后肢缺血模型，按缺血不同的时间取下血管夹开始再灌流1 h或经右股静脉注入NSMA 1～1．5 mg/kg后再松开动脉夹灌流1 h。
骨骼肌线粒体的提取：分别于各组设定的条件下迅速取下右腓肠肌1g在水浴中剪碎。加分离介质(mmol/L)(甘露醇42、蔗糖14，EDTA0．2，HEPES 1，5g/LBSA 1 g)研磨制成骨骼肌匀浆并于4℃下600 g和10000g两次10min离心后，获得棕色沉淀即为骨骼肌线粒体。将沉淀悬浮于0．5mL分离介质中。蛋白含量用考马斯亮兰测定。线粒体呼吸控制率的测定：用极谱法测定以琥珀酸为呼吸底物的线粒体呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)。反应槽中放入测定介质，加0．5mol/L琥珀酸10μL出现态4呼吸，2min后加0．5mol/L ADP10μL出现态3呼吸。
骨骼肌线粒体抗氰呼吸的测定：反应槽内加入所需测定介质(mmol/L)(甘露醇60，氯化钾2，TrB-HCl 2，KH2PO4 0．001，EDTA0．04)。加入0．5mol/L琥珀酸10μL，出现态4呼吸，再加入0．5 mol/LADP10μL出现态3呼吸，待ADP完全消耗又恢复态4呼吸时立即加入3g/L氰化钾3μL。
经皮氧监测：固定GJYH-90型经皮氧分压传感器连续、无创地测定动脉氧分压及局部相对血流量。
生化指标测定：分别收集上述各组大白鼠右下肢腿部肌肉制备组织匀浆采用硫代巴比妥显色法测定MDA含量和测定髓过氧化物酶主要在参考文献的基础上，作了适当改良。
骨骼肌线粒体超微结构观察：随机抽取部分实验组骨骼肌，按透射电镜制备超薄切片，电镜下(50000，60000放大倍数)观察并对线粒体的骨骼肌摄片。
主要观察指标：骨骼肌线粒体超微结构，不同条件下呼吸控制率、抗氰呼吸、丙二醛、髓过氧化物酶的变化。
统计学分析：所得数据以x±s表示，由第一作者用SPSS 8．0统计软件进行统计分析，经t检验比较各组间的差异，P<0．05为差异有显著性意义。
2结果
2．1实验动物的数量分析
选取Wistar大白鼠35只，分7组，每组5只，进入统计分析的大鼠保持为7组，各5只，无缺失值。
2．2不同条件下呼吸控制率、抗氰呼吸、丙二醛、髓过氧经物酶的变化
见表1。
2．3经皮氧分压及相对血流量
阻断前，氧分压(PO2)稳定在8．0～9．8kPa，加热功率(W)在262～304mW；阻断中分别为PO2：0～1mmHg，W：4．5～6．2mW；阻断2h再灌注的起初2minPO2：35mmHg，W：349mW，随后PO2：18～20mm Hg，W：76～99mW；阻断6h再灌注的PO2：0mmHg，W：1．0mW，此时被阻断的肢体无痛觉反应。
2．4骨骼肌线粒体超微结构的变化
与对照组比较：缺血组随着时间延长到6h，大部分肌纤维排列紊乱，见糖元颗粒减少，可见线粒体膜断裂，嵴消失；再灌注组随缺血时间延长，肌纤维排列紊乱严重，糖元颗粒减少，线粒体膜断裂，并出现自溶的髓样小体；经NSMA治疗后的肌纤维排列紊乱有明显改善，正常清楚，大部分线粒体完整，可见中等量的糖元颗粒。
3讨论
NSMA为专一抑制泛醌反应的呼吸链抑制剂，它对呼吸链中催化泛醌反应的琥珀酸-泛醌还原酶，泛醌-细胞色素C还原酶和NADH-泛醌还原酶均有抑制作用。徐建兴发现NSMA对提取的呼吸链酶系有明显的抑制作用，用人工电子受体2．6-二氯酚吲哚酚钠、吩嗪钾硫酸盐的实验观察，推论NSMA抑制位点在呼吸链中吩嗪钾硫酸盐和DCHP的电子给体之间，这恰恰是复合物Ⅱ和Ⅲ相交接的地方。
呼吸链的电子漏是生物体中氧自由基(O2-)的恒定的主要来源。由于缺血供氧不足，线粒体内呼吸链的电子传递紊乱，使电子传递链酶氧化还原状态转变为还原状态，并引起还原当量积聚，当氧气再次进入组织时(再灌注期间)，积聚的还原当量释放电子与O2结合生成O2-，O2-经超氧化物歧化酶歧化生成H2O2。氧自由基又反过来引起生物膜结构蛋白质和脂质过氧化，损伤线粒体膜的通透性，引起电子传递链酶活性的进一步下降，形成恶性循环，从而使氧自由基生成进一步增加，终造成细胞的坏死或凋亡。线粒体的氧自由基代谢状态与细胞凋亡之间存在因果关系。孙绪德等在有关缺血再灌注损伤的研究中发现细胞凋亡机制与细胞内钙超载、氧自由基生成等因素有关；缺血再灌注后，脂质过氧化反应增强，自身抗氧化能力减弱。卓安山等在研究中观察到缺血再灌注损伤后在一定时限内组织细胞主要表现为凋亡，很少发生坏死。
RCR是反映线粒体结构完整性及其氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标，是指加入ADP刺激后的呼吸(态3呼吸)和ADP耗尽后的呼吸(态4呼吸)之比。线粒体中，呼吸链将电子传递给氧的途中，“漏出”部分电子，引起氧分子进行单电子还原产生超氧阴离子自由基O2-和双氧水H2O2，这一路径的耗氧是对氰化物不敏感的。
白细胞在骨骼肌缺血再灌注损伤中起重要作用。髓过氧化物酶由活化的中性粒细胞产生，是中性粒细胞的标志酶。以往的研究表明，炎性反应对大量的中性粒细胞活化是诱发器官功能障碍的危险因素之一。PMN含有NADPH氧化酶，可还原分子氧为超氧阴离子；激活的中性粒细胞分泌髓过氧化物酶，催化过氧化氢和氯离子形成次氯酸。次氯酸为强氧化剂和超氧阴离子可氧化巯基，使血红蛋白和细胞色素失活，再使蛋白质降解而造成组织细胞损伤。
本研究结果表明，随着缺血时间的延长，RCR呈下降趋势，反映了在缺血、缺血再灌注后的线粒体活性显著降低，氧化磷酸化偶联程度下降。这意味着用于供能的氧耗减少，导致线粒体氧利用率降低。缺血后电子漏增加，再灌注后电子漏有增加趋势。电子漏的增加势必要影响呼吸链正常电子传递，使ATP产生减少，能量不足，从而导致抗氧化保护机制对氧自由基的清除作用减弱。实验说明缺血缺氧时组织中脂质过氧化产物增加，MPO的活性增加，反应了组织的损伤；再灌注后发生血流减慢直至停止，此时脂质过氧化产物进一步增加和MPO的活性持续增加，则反应了缺血区域组织、除强氧化剂次氯酸和超氧阴离子造成组织细胞损伤外，尚有不可忽视的血管中有大量的白细胞积聚以至血管腔狭窄，并可引起继发性血栓形成，从而使血管阻塞，缺血缺氧进一步加重，这样周而复始的恶性循环导致组织细胞的坏死或凋亡。伴随着电子漏增加、丙二醛浓度增加、髓过氧经物酶的活性增高，与组织的损伤程度呈正相关。NSMA能影响呼吸链电子传递，使氧自由基减少，进而维持线粒体结构的完整性和线粒体的功能活性，使细胞进行正常的氧化磷酸化，从而减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。沈明等在脑缺血再灌注损伤的研究中也观察到NSMA对缺血再灌注损伤的保护作用。
研究中还有一值得注意的问题，缺血再灌注时电子漏比正常对照组明显增加，若这部分漏出电子均用于产生氧自由基，骨骼肌线粒体内氧自由基水平应显著增高，可能损伤线粒体功能。但测得反映线粒体功能的RCR再灌注组均高于缺血组。依据徐健兴提出的线粒体参与氧自由基代谢的功能，作者分析，实验结果不相符有可能是再灌注期间氧气进入组织，由缺氧积聚的电子传递链酶还原当量释放电子，未全部用于产生氧自由基，部分尚未完全受损的线粒体抗氧化保护系统被激活。
结论：
缺血、缺血再灌注骨骼肌中线粒体RCR下降、电子漏增加，证实线粒体活性降低及其抗氧化保护作用减弱是发生缺血再灌注损伤的主要原因。NSMA为专一抑制泛醌反应的呼吸链抑制剂，对缺血、缺血再灌注损伤有预防和治疗作用。