《生命科学》2011年第10期
朱京谭晓荣
河南工业大学生物工程学院郑州450001
摘要：
活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自噬在人体内作用广泛，且与人类的健康密切相关。两者之间关系复杂，ROS作为诱导自噬的信号分子，参与多种诱导自噬的信号途径，在自噬的形成过程中起着重要作用，而自噬具有减少ROS损伤的作用。对ROS与自噬之间的关系，包括ROS介导自噬的分子机制，以及ROS和自噬在肿瘤、神经退行性疾病和衰老中的作用进行综述。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一类化学性质活泼，具有较高氧化活性的分子或离子的总称。主要包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO·）、一氧化氮（NO·)等。线粒体是ROS的主要产生部位，在线粒体呼吸过程中会有少量的电子从线粒体电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ中漏出，与O2结合生成ROS。此外NADPH氧化酶和过氧化物酶等也能产生ROS。过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤，从而影响其正常生理生化功能。生物体本身存在清除ROS的体系，包括SOD酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸等，这一体系使生物体内ROS保持在对机体无害的水平。
Ashford和Porter在1962年用电子显微镜在人肝细胞中初次观察到自噬(autophagy)。自噬广泛存在于真核细胞内，正常情况下细胞内的自噬处于低水平，在受到外界环境刺激时(饥饿、营养缺乏、氧胁迫等)自噬水平升高，细胞内的长寿命蛋白、可溶性蛋白、受损细胞器等胞内物质会被转运到溶酶体进行降解，重新利用以满足细胞所需，利于细胞存活。但当自噬水平过高时，会因过度“吞噬”胞内物而造成细胞死亡。
一般情况下，细胞内的ROS和自噬均处于正常水平，并不会对细胞造成过度损伤。但在一些不利的状态下(如饥饿、营养缺乏、药物刺激、剧烈的环境变化、细菌感染以及各种疾病等)，细胞内的ROS和自噬水平都会显著升高。ROS与自噬在不利状态下的相同反应，暗示着两者可能存在着联系。ROS在细胞凋亡过程中的重要作用，已被人们所肯定。研究表明，在细胞自噬过程中ROS同样有着重要的作用。本文论述ROS与自噬的相互作用关系及其分子机制，以及ROS在细胞自噬过程中所起作用。
1自噬与ROS的关系
细胞自噬过程常常会伴随着ROS含量的变化，能够诱导自噬的药物，也能导致细胞内ROS含量的改变。例如脂多糖类(LPSs)和泛半胱天冬酶抑制剂benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(Z-VAD)能够诱导巨噬细胞产生自噬，并且会使其ROS含量升高。此外在营养缺失以及疾病过程中产生的自噬同样伴随着细胞内ROS水平的变化。如果用抗氧化剂降低ROS的含量，自噬水平会降低。如在癫痫持续状态下的小鼠细胞内，自噬水平升高，产生过量ROS，施以维生素E，细胞内ROS含量降低，自噬受到部分抑制。这些情况表明ROS与自噬之间存在密切关系，主要表现在以下两方面。
1．1自噬降低ROS毒性
正常情况下，生物体内的ROS处于较低水平，低水平的ROS在信号转导、免疫反应以及基因的表达调控过程中起着重要作用，而ROS的过量累积则会对细胞造成毒性伤害。细胞内的蛋白质能够被ROS氧化，丧失正常的功能并累积产生毒性。由于线粒体是ROS的主要来源，且线粒体DNA比核DNA更加脆弱，因此线粒体更易遭受ROS的攻击而产生损伤。过量的ROS还会使线粒体发生去极化损伤，导致线粒体自噬。线粒体自噬是一个特异性的选择过程，是细胞清除受损线粒体，维持自身稳态的重要调节机制。但线粒体自噬也有可能会促进细胞凋亡。自噬作为细胞在不利环境下的一种存活机制，可通过清除被ROS损伤的细胞器或蛋白质，降低ROS对细胞的毒性伤害，保护细胞。但有报道认为，自噬的激活也可加剧ROS的累积。另外在动物水平，如果体内固有的ROS清除系统发生异常，致使ROS累积，那么机体会补偿性地提升自噬水平来降解ROS。例如，在ROS清除剂超氧化物歧化酶(SOD1)发生突变的转基因小鼠体内，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)受到抑制，而自噬标志物Ⅱ型微管相关蛋白质1轻链3(LC3-Ⅱ)累积。如果自噬的产生受到抑制，会导致细胞内ROS含量的升高。例如，在自噬相关基因突变的酵母菌细胞内ROS水平会比野生型的酵母菌株的高。自噬虽然能够抵抗ROS的毒性，但是如果细胞内的ROS水平超出自噬所能承受的范围，即通过自噬仍不能清除过量的ROS，始终保持在较高水平，则会引起细胞过度自噬，终导致细胞死亡。可以看到，原本作为细胞存活机制存在的自噬，一旦被过度激发，反而会造成细胞死亡。这提示，生物体内的生化反应异常复杂和准确，在探索和研究中一定要谨慎。
1．2 ROS介导自噬发生
ROS可诱导自噬并在自噬过程中起重要作用，多种情况能够引起细胞内ROS的增加，进而检测到自噬标志物LC3-Ⅱ的累积。一些外源物质通过刺激细胞产生ROS，进而诱导自噬。例如槟榔提取物和线粒体电子传递链抑制剂等能够引起癌细胞中ROS水平升高，诱导自噬产生；苯并恶嗪衍生物DBO通过促使胞内ROS水平升高诱导自噬；直接添加H2O2也会诱导自噬产生。另外在一些疾病中，内源性的ROS水平也会升高，引起自噬，如在坏死性小肠结肠炎疾病中，肿瘤坏死因子TNF-α可以显著的造成线粒体功能异常，进而产生大量ROS，诱导线粒体自噬的产生。在一些神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)中，ROS在自噬的诱导过程中也起着重要作用，而肿瘤细胞中ROS也能诱导自噬产生。
2 ROS影响自噬的机制
通过前文的论述，可知ROS能够诱导自噬的产生，作为介导自噬的信号分子，其作用机制目前仍未清楚，还需要深入研究。下面列举了一些已经报道的相关分子机制，从中可以看到其机制的复杂（图1)。
ROS自身可通过Beclin-1、HMGB1、p38/p53、GSK-3β、Ca来诱导自噬；
也可通过抑制Atg4、Akt/mTOR进而诱导自噬；
TIGAR间接降低ROS水平，阻碍自噬产生。
图中用虚线标注的Ca途径为推测的可能途径。
(ROS：活性氧；autophagy：自噬；HMGB1：染色质相关的核蛋白
TIGAR：一种p53靶基因编码的蛋白TP-53诱导的糖酵解和凋亡调控因子；)
图1 ROS影响自噬的途径
酵母自噬发生过程中，Atg4对Atg8(LC3、GATE-16的同源物)的C端进行剪切，被剪切后的Atg8与磷脂酰乙醇胺(PE)结合，然后Atg8-PE结合到自噬小体膜上，参与自噬小体的装配，促进自噬小体的成熟。当自噬小体与溶酶体融合后，Atg4剪切Atg8-PE释放出Atg8。RuthScherz-Shouval等报道，饥饿促使细胞产生ROS诱导自噬，在此过程中H2O2与HsAtg4A(属Atg4家族)作用上调自噬水平。HsAtg4A是半胱氨酸蛋白酶，在其活性位点下游4个氨基酸处有一半胱氨酸残基Cys，用丝氨酸替代Cys81后，其氧化还原敏感性降低，以GATE-16为标记的自噬小体的形成受到显著抑制。H2O2可能作用于Cys81使得HsAtg4A部分失活，丧失剪切Atg8-PE的能力，以至于Atg8-PE在细胞内积累，促进自噬的产生。
Beclin-1(Atg6的同源物)是与人体细胞自噬形成相关的一种重要蛋白，Beclin-1和Beclin-2相互作用调控自噬水平，上调Beclin-1的表达量能够促进自噬的产生。有研究表明Beclin-1的表达量与ROS相关，例如在癌细胞中氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins)通过过氧化物酶体增生物激活受体(PPARγ)激活脯氨酸氧化酶，形成过氧化物上调Beclin-1，终引起自噬。在此过程中Beclin1的上调需要脯氨酸氧化酶产生的ROS；另一种新的自噬调控因子，染色质相关的核蛋白HMGB1在饥饿诱导的细胞自噬中有重要作用，ROS和Beclin-1参与HMGB1对自噬的调控。在饥饿状态下，细胞内ROS含量增多，通过与ROS相关的信号途径可以促使细胞核内的HMGB1向胞质转运，在细胞质中HMGB1取代Beclin-2直接与Beclin-1相互作用，进而上调自噬水平。
mTOR和classⅢPI3K对自噬有调控作用，ROS可通过它们对自噬产生影响。例如，在U251型人脑胶质瘤细胞中，H2O2通过激活classⅢPI3K/Beclin1信号通路，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路中的Akt和mTOR的活性，诱导自噬，对自噬有调节功能的Beclin-2也参与其中。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)也与自噬形成相关。水飞蓟素(silibinin)可以诱导HT1080型人纤维肉瘤细胞发生自噬型细胞死亡，这一过程受ROS-p38的介导，p38是MAPK蛋白家族成员，ROS-p38信号途径激活p53引起自噬型细胞死亡。
此外在MES-13型肾小球系膜细胞中，镉(cadmium，Cd）诱导自噬产生，这一过程受3β糖原合成酶激酶(GSK-3β)信号途径调节。ROS还能与一些离子通道蛋白互作，影响一些离子(Ca2+、K+等)的正常转运，而Hoyer-Hansen等认为Ca2+含量的增加能有效诱导自噬，说明ROS可能通过影响细胞内Ca2+含量而诱导自噬。
一种p53靶基因编码的蛋白TP-53诱导的糖酵解和凋亡调控因子(TIGAR)能够间接的降低ROS水平，阻碍自噬产生。抑制TIGAR的表达，则能促进ROS依赖型自噬的产生。
ROS的作用是广泛的，其诱导自噬的信号通路不止一条。ROS信号可能通过某一条或者多条信号通路引起自噬，分子机制非常复杂。另外，究竟通过哪条信号途径诱导自噬还受到多种因素的影响，如细胞型、受刺激类型、实验环境等。另外，在自噬的调控过程中究竟哪一种ROS起作用，也值得去探究。一些研究者认为H2O2是调控自噬的主要ROS，但Chen等认为超氧阴离子是调控自噬的主要ROS。
3 ROS介导的自噬与疾病
随着对自噬研究的不断深入，越来越多的研究表明自噬与多种疾病有关联，而在一些疾病中也检测到较高水平的ROS。在肿瘤、神经退行性等疾病中，ROS诱导的自噬对疾病的产生和发展有着重要作用。
3．1肿瘤
肿瘤细胞普遍处于缺氧状态，缺氧诱导因子(HIF-1)在细胞对缺氧的应答中起关键作用。在氧含量正常的情况下蛋白酶体降解HIF-1，抑制其活性，但在肿瘤细胞中线粒体产生的ROS可以使HIF-1稳定的存在。HIF-1能够活化BNIP-3(Bcl-2/E1B-19K-interactingprotein3)和NIX(BNIP3类似物)，活化的BNIP-3和NIX与Beclin-2结合，释放Beclin-1诱导自噬产生，自噬可以减少ROS的生成和线粒体的聚集，有利于肿瘤细胞在缺氧条件下存活，对肿瘤有促进作用；饥饿或者雷帕霉素处理的HeLa细胞自噬过程中活化的NADPH氧化酶产生的ROS能够激活JAk2/STAT3(Janus激酶/信号转导子与转录激活子3)途径，自噬过程通过活化JAk2/STAT3和随后分泌的生长因子促进癌细胞存活。另外Red-Br-nos(微管蛋白结合物诺斯卡品的类似物)能够诱导前列腺癌细胞PC-3产生自噬，并释放ROS，清除ROS会降低自噬水平。在多发性骨髓瘤细胞中，HYD1(一种D-氨基酸肽)诱导的自噬有助于癌细胞的存活，ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸能够抑制HYD1诱导的自噬，这些均表明ROS在癌细胞自噬的产生过程中起重要作用。而且在一些癌细胞中，自噬作为细胞凋亡的抵抗机制，也有促进癌细胞存活的作用。例如，冬凌草素甲能诱导鼠科纤维肉瘤细胞产生ROS、自噬和凋亡，抑制自噬促进细胞凋亡，而促进自噬能促进癌细胞存活。
另据Gao等报道，有抗癌作用的塞来昔布(celecoxib)衍生物OSU-03012诱导肝癌细胞产生自噬型细胞死亡，且ROS的积累与自噬的产生相关。表明自噬具有抗癌作用，这与其促进癌细胞存活的作用相反。
综上所述，自噬对癌细胞有双重作用，但都与ROS有关，究竟是促进还是抑制肿瘤，存在诸多争议。但应当看到，适度的自噬对癌细胞的存活是有利的，一旦自噬水平超过一定阈值，则会造成癌细胞的死亡，抑制肿瘤生长，而ROS能够影响自噬水平，因此推测ROS也是决定癌细胞存活的因素。
3．2神经退行性疾病
自噬能够清除并降解在帕金森病(PD)和阿尔茨海默病中产生的有害蛋白质。许多情况下，在神经退行性疾病中能够观测到氧化应激增强及ROS的生成，造成自噬水平的升高。例如在多巴胺D(2)受体敲除的PD小鼠模型中，氧胁迫(oxidative stress)的增强和聚合α-共核蛋白的形成(α-synuclein)与升高的自噬水平相关。Alessandro等发现，PD患者的外周血单个核细胞(PBMC)中经硝基酪氨酸（NT)修饰的α-共核蛋白的聚集性增强，其含量与细胞内ROS的浓度相关，而且PBMC中自噬水平显著升高。
β-淀粉样蛋白是AD的主要致病因子，并能诱导自噬，此过程受ROS介导。自噬导致溶酶体中β-淀粉样蛋白的累积，造成溶酶体膜通透性增加，终可能引起细胞凋亡。
4衰老
衰老是一种重要的生理现象，细胞和组织中的不利变化随时间流逝而不断积累引发衰老，其自噬功能会不断减弱，终会导致死亡。在一些长寿命细胞内，如心肌细胞、神经元细胞，脂褐质会随时间不断产生并沉积下来，阻碍线粒体的自噬，致使衰老的线粒体累积，产生更多的ROS，氧化应激的不断增强，反过来继续损伤线粒体和溶酶体，激发促凋亡途径，终导致细胞死亡。因此，清除损伤线粒体的自噬，即线粒体自噬有抗衰老的作用。此外，在衰老的酵母细胞内，人类精液中的亚精胺组分能可通过抑制组蛋白酰基转移酶（HAT)活性而触发组蛋白H3的渐进性脱乙酰基作用，进而抑制氧化应激。这种染色质乙酰化状态的变化能上调多种自噬相关的转录物，促进自噬水平升高，从而延长寿命。
5讨论
综上所述，ROS诱导的自噬在一定范围内对机体有积极作用，但过量的ROS会诱导自噬型细胞死亡，对机体产生不利影响。尽管许多ROS介导的自噬产生途径被发现，但是对完整的信号转导途径仍缺乏清晰的认识，需要不断深入研究，以完善相关信号通路。另外存在多种ROS，它们是单独的调控自噬，还是一起作用于自噬，存在争论!需要找到或开发出更为准确的探测和标记各种ROS的方法，以便更为准确的认识它们各自在自噬中的具体作用。可以看到，ROS和自噬在细胞内的作用非常广泛，信号通路异常复杂，而且与人类健康密不可分，但将现有的并不完整的理论应用到临床治疗上是非常危险的，在这方面应当谨慎对待。