尤寿江石际俊张艳林刘春风
《中国病理生理杂志》2011年01期
【作者单位】：苏州大学附属第二医院神经内科；
苏州大学神经科学研究所衰老与神经疾病实验室；
传统观念认为，活性氧类(reactive oxygen species，ROS)只是一类损伤细胞的毒性物质，近年的研究发现ROS作为一种信号分子参与细胞的增殖、分化及凋亡等多个生理过程。自噬是一种溶酶体依赖性的细胞内大分子物质和细胞器的降解过程，不仅在生理情况下发挥重要作用且参与一些疾病的发生发展。新的研究表明ROS，特别是线粒体源性ROS，作为信号分子参与自噬的调节。本文集中讨论了ROS和自噬的关系以及ROS介导的自噬在疾病发生发展中的作用，从而为疾病的治疗提供新的靶点和策略。
1 ROS和氧化应激
ROS是生物体有氧代谢产生的一类活性含氧化合物的总称，包括超氧阴离子(O2·-)、自由基(超氧化物、羟基自由基)和过氧化物(过氧化氢，H2O2)等。这些物质可来源于生物分子的电离辐射、体内一些酶如NADPH氧化酶(NOX)和双重氧化酶(DUOX)等的合成，同时线粒体在正常氧化呼吸时也会产生少量的ROS，如超氧化物及H2O2。在生理状态下，胞内的生长因子、细胞因子及钙信号参与了ROS产生的调节，低水平的ROS通常能够被一些抗氧化的酶或物质降解，如谷胱甘肽(胞内氧化还原的主要缓冲物质)、硫氧蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶等。所以ROS产生和降解平衡的维持对于细胞发挥正常生理功能具有非常重要的意义。
如果胞内抗氧化物质不能够有效降解ROS，就使得ROS在胞内蓄积从而引起氧化应激。蓄积的ROS氧化胞内的DNA、蛋白、脂质及细胞器。被ROS氧化的蛋白及脂质不仅失去应有的功能而且易于在胞内聚集，形成脂褐素等毒性物质，并通过影响溶酶体的活性而引起细胞死亡引。另外，氧化应激也引起线粒体的严重损害，线粒体内积聚的ROS可以使其DNA突变、脂质过氧化以及线粒体膜通道的开放，从而影响线粒体的功能。氧化导致的线粒体膜渗透性通道的开放导致线粒体膜的通透性增加，引起线粒体内ATP及Ca2+含量下降，致使线粒体肿胀及细胞色素C的释放。研究认为线粒体此种严重的损害可以引起自噬、自噬性细胞死亡、凋亡和坏死。
2自噬
自噬是生物体通过溶酶体或囊泡降解胞内成分的总称，不但在细胞的分化和成熟过程中起重要作用，而且在应对各种应激时也发挥着关键作用。
自噬主要有3种形式：大自噬(macroautophagy)即所谓的自噬、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。大自噬通过双层膜结构包裹胞浆内物质，如蛋白及细胞器，形成自噬囊泡，自噬体的外膜或者液泡膜与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体，溶酶体内的水解酶降解其包裹的底物。小自噬是溶酶体膜通过内吞作用直接包裹胞浆内物质。CMA途径只能选择性降解带有特定信号基序赖-苯丙-谷-精-谷氨酰胺序列(KFERQ)的胞浆蛋白，胞浆内的伴侣蛋白特异性地识别这种信号基序然后与溶酶体膜上的受体溶酶体结合性膜蛋白2a(lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a)结合从而将底物转运到溶酶体内降解。
尽管，自噬起初被认为是非选择性的降解过程，但目前的研究认为自噬可以通过优先降解胞内过多的细胞器即选择性自噬，如过氧物酶体自噬（pexophagy)、内质网自噬(reticulophagy）和线粒体自噬(mitophagy）等，从而在机体应对各种应激过程中发挥重要作用。其中和氧化十分密切的是线粒体自噬。
3自噬在机体应对氧化应激过程中的双重作用
近年，自噬既可以保护细胞又可以引起细胞死亡的双重作用已被人们广泛接受。同样，在氧化应激时自噬也发挥着双重作用。在应对氧化应激损伤时，机体会产生多种防御机制：上调抗氧化剂的水平、通过泛素蛋白酶体系统来降解特定的蛋白、通过自噬来降解已损伤的蛋白和细胞器。
一方面自噬的优先激活通过清除氧化的蛋白及损伤的细胞器而有利于细胞的存活。过多的ROS及其它物质可以通过优先激活线粒体自噬选择性地降解氧化损伤的线粒体，从而减轻其对细胞的损害。过多的ROS可以诱导及加强CMA途径对氧化蛋白的清除，因为氧化的蛋白相比未氧化的蛋白更易通过分子伴侣转运到溶酶体内，而且在较弱的氧化应激情况下溶酶体更易结合及转运CMA底物蛋白，从而有利于细胞存活。同样自噬在清除正常衰老细胞中过多氧化的蛋白发挥重要作用，但随着年龄的增长自噬的活性下降，不能够有效地清除氧化的蛋白，导致衰老及一些老年性疾病，如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、糖尿病等的发生。
另一方面自噬可以直接诱导被氧化细胞的死亡。以往的研究认为，在氧化应激较强时，凋亡和坏死的机制就会被激活从而诱导细胞死亡。
4 ROS在自噬激活中的作用
4．1 ROS作为一个信号分子参与细胞的自噬性死亡
ROS作为一种胞内信号分子参与胞内许多生物过程，参与细胞增殖、凋亡、免疫及抗微生物过程。在神经生长因子（nerve growth factor，NGF)缺乏情况下，ROS初次被证实作为一种信号分子参与神经细胞的自噬性细胞死亡(autophagiecell death，ACD)。NGF的缺陷导致大量ROS在神经元线粒体内蓄积，ROS通过引起线粒体膜脂质过氧化，线粒体功能异常，终引起自噬性细胞死亡。通过敲除自噬关键基因beclin 1和自噬相关蛋白7(Atg7)，发现NGF缺陷导致细胞死亡减少，进一步明确自噬参与其中，且证明H2O2是诱导这种自噬性死亡有效而且必需的。应用抑制线粒体氧化呼吸链的药物如鱼藤酮可以使线粒体内产生过多的ROS引起自噬性细胞死亡。以上研究表明ROS作为信号分子通过诱导自噬参与了细胞的死亡。目前还并不清楚具体参与这些白噬性细胞死亡的ROS，但有学者认为可能有多种ROS同时参与其中，如O2·-和H2O2。
研究发现自噬的激活又可以加剧ROS的蓄积。Caspase抑制剂可以导致自噬选择性地优先降解过氧化氢酶，导致线粒细胞内ROS蓄积并终引起细胞死亡。通过ROS蓄积和自噬之间反馈环路的假说可以解释这一现象：低水平的ROS激活自噬，自噬的激活降解过氧化氢酶反过来又可以增加H2O2的水平，H2O2的增加进一步激活自噬。这些结果表明，过氧化氢酶的降解或许导致H2O2信号的延长，在自噬性存活向自噬性死亡转化过程中起重要作用。
4．2 ROS参与细胞的自噬性存活
近期的研究发现ROS也参与饥饿诱导自噬的调节，而这种自噬的激活有利于细胞的存活。在饥饿时，通过Ⅲ型PI3K-mTOR途径引起线粒体内H2O2蓄积从而激活自噬。
饥饿诱导的氧化信号在饥饿的早期就会出现，H2O2通过氧化底物自噬相关蛋白4(Atg4)发挥作用。Atg4是自噬途径中重要的蛋白之一，其功能是切割泛素样蛋白家族自噬相关蛋白8(Atg8)蛋白的c末端，Atg8是一个与自噬溶酶体膜上的磷脂酰乙醇胺结合的重要的物质。Atg4只能切割与溶酶体膜共价结合的Atg8，切割形成的游离的Atg8在胞浆中可以循环利用。而氧化的Atg4则不能够切割与溶酶体膜共价结合的Atg8从而诱导自噬的激活。在这个过程中Atg4是ROS诱导自噬性细胞存活信号通路中的一个中间物质。进一步的研究认为H2O2相比其它ROS信号更有优势：H2O2相对稳定，寿命长及作为一种中性离子更易通过线粒体膜。然而，仍然不清楚的是在这条途径中Atg4是否是H2O2的仅有底物?Atg4的抑制仅存在于饥饿诱导的自噬还是存在于所有的白噬途径中?
既然ROS参与了自噬的调节，那么ROS信号的来源是什么呢?目前的研究认为参与自噬调节的ROS主要来源于线粒体。ROS的产生和降解之间平衡的破坏是线粒体内ROS聚集的主要原因。大量研究表明，线粒体产生的ROS可以诱导自噬：
(1)应用rotenone、4，4，4-三氟-1-[2-噻吩]-1-3-丁烷二酮（thenoyltrifluomacetone，TTFA)、H2O2或2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)等抑制线粒体膜的呼吸链复合体可以诱导线粒体内ROS蓄积，从而引起细胞的自噬性死亡；
(2)雷帕霉素和神经生长因子（nervegrowth factor，NGF)缺乏使得线粒体膜脂质氧化从而上调自噬；
(3)营养缺陷诱导ROS蓄积所致的自噬激活也与线粒体密切相关。
因此，我们推测线粒体可以作为诱导自噬的氧化还原信号的来源。
4．3线粒体在自噬体形成中的作用
线粒体可以通过产生ROS调节自噬体的形成，然而其对自噬的调节是否只能通过ROS产物起作用呢?有研究显示，在酵母中自噬相关蛋白9(Atg9)(与自噬相关的两个胞膜内蛋白之一)在前自噬溶酶体结构及其周围结构之间循环，这表明自噬体形成过程中存在膜成分的循环利用；同时位于周围的Atg9活性结构存在于线粒体附近。已明确哺乳动物细胞内的两个Atg9亚型且这两个亚型都参与自噬溶酶体膜的合成，同时线粒体也参与其中。
据以上的研究可知线粒体是自噬诱导信号ROS的主要来源之一，同时可能还提供部分自噬溶酶体膜合成的原料。线粒体来源的ROS转运到胞浆产生一个氧化梯度，同时氧化其底物分子如Atg4及一些未知的分子，氧化的Atg4失去活性不能切割自噬溶酶体膜结合的Atg8，从而诱导自噬的激活。因为ROS是一类短寿命的物质，氧化过程只能在线粒体周边，而在远离线粒体的Atg4具有活性并可以分离位于自噬体上的底物Atg8使其参与循环利用。然而，目前还没有仪器能够检测氧化梯度的变化从而证实这种推测。
5 ROS介导的自噬与疾病
ROS介导的自噬不仅与正常的老化相关，而且可以直接导致或加剧一些疾病的发生发展。一些与氧化有关的疾病中溶酶体系统功能受损起重要作用，如动脉粥样硬化、AD和PD。虽然这些疾病在后期阶段有着共同类似的改变即未消化物质在溶酶体内蓄积，但起初的氧化蛋白进入溶酶体的途径各不相同。
5．1 ROS介导的自噬与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化斑块源自血管系统内溶酶体应对氧化损伤的反应。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)转运胆固醇聚集到动脉壁内，随后巨噬细胞迁移到胆固醇积聚的位置通过溶酶体来包裹清除氧化的蛋白。至后巨噬细胞内溶酶体碱性化导致溶酶体内未降解物质的积聚，巨噬细胞充满了超载的溶酶体，成为吞噬活性有限的“泡沫细胞”。研究表明氧化的胆固醇及ROS在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用，氧化的胆固醇通过损伤溶酶体从而影响自噬对于泡沫细胞的清除，而ROS随着损伤细胞及胞外碎片的积聚而增加，从而使病变一直存在，我们的课题组通过培养人脐静脉内皮细胞证实大自噬确实参与对ox-LDL的降解，在动脉粥样硬化的形成中起着重要的作用。
5．2 ROS介导自噬和阿尔茨海默病
AD是老年人常见的神经退行性疾病，它的病理学特征为胞内具有毒性的肽片段Aβ-42的聚集。研究表明在Aβ-42聚集的早期就发现有大自噬的激活，并作为一种保护性机制阻止细胞进一步损害。随着疾病的进展一方面自噬的活性下降且自噬溶酶体的融合障碍；另一方面Aβ-42抑制溶酶体的降解功能使聚集很快达到毒性水平，导致溶酶体内产生ROS。而过多的ROS可以抑制自噬体对其内物质的降解从而加剧内容物的积聚，使溶酶体膜内外的质子梯度改变并引起细胞死亡。尽管ROS参与了自噬介导的细胞死亡，但其在AD发病中的具体机制仍有待于进一步阐明。
5．3 ROS介导的自噬与PD
PD是以黑质致密部和纹状体多巴胺能神经元内出现主要含有聚集α-synuclein的包涵体-Lewy小体为病理标志的神经变性疾病。多巴胺非常容易被氧化，胞内和胞外实验证实DA的氧化与α-synuclein的积聚相关。大量研究表明，自噬参与了α-synuclein的降解过程：野生型α-synuclein蛋白通过CMA途径降解，当α-synuclein过表达时，大自噬通常被诱导来弥补CMA缺陷。我们课题组通过构建表达突变型α-synuclein的PC12细胞系(A53T和A30P)，分别给于自噬诱导剂——雷帕霉素和抑制剂——渥曼青霉素，证实了在PD细胞模型中自噬水平的增高，促进自噬有助于细胞的存活。予以MPP+处理野生型、A30P和A53TPC12细胞，结果显示野生型的α-synuclein可以抑制MPP+诱导的ROS的产生，而在A30P和A53T突变的PD模型细胞中，MPP+可以明显增加ROS的产生，这表明ROS在α-synuclein的产生和清除中发挥着重要作用。
6结语
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，这种现象的出现可能是在分化过程中促使细胞进行重新组织的需要而产生的，所以自噬与细胞的生长发育过程和多种疾病的发生、发展均密切相关。目前的研究表明ROS可以作为一些疾病治疗的新靶点，具有潜在的治疗价值。对于因自噬体的数量及活力下降引起的与蛋白降解障碍相关的老年性疾病，如PD、AD、糖尿病和动脉粥样硬化等，可以通过上调ROS水平从而激活自噬来降解这些蛋白达到防治疾病的目的。同时ROS对于肿瘤的研究和治疗也有很大的价值，已有研究证实一些药物可以通过引起ROS增多而上调自噬以杀伤肿瘤细胞。尽管ROS，特别是线粒体来源的，是调节自噬过程的一种信号分子，但其诱导自噬的具体机制和通路还不是很清楚，ROS诱导的自噬性细胞存活和死亡之间的关系仍待于进一步研究。