张发仁，许丽艳，沈忠英，李恩民
(1汕头大学医学院肿瘤病理学教研室；
2汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，广东汕头515041)
汕头大学医学院学报2005年第4期
[摘要]
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。生命体籍此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定，这一过程在细胞清除废物、结构重建、生长发育中起重要作用。本文主要对自噬体的形态和发生过程、分子机制、生化检测、与细胞凋亡的关系及其生理、病理功能等方面进行概述，以期较为全面地了解细胞自噬作用和新研究动态的相关资料。
自噬是细胞通过单层或双层膜包裹待降解物形成自噬体，然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体并进行多种酶的消化及降解，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。而细胞对这种合成与降解的精细调节，对维持细胞的自身稳态有重要意义。降解细胞内物质的途径主要有：
①蛋白酶体，主要消化短寿命蛋白质；
②通过形成自噬体，将待降解物(如大多数长寿命蛋白质和细胞器)运输到溶酶体内消化。
自噬是溶酶体降解途径的主要步骤，通过对自噬体的检测，可了解自噬体形态和发生过程、分子机制、与细胞凋亡的关系及其在某些疾病发生中的作用。
1自噬与自噬体的形态及发生过程
自噬是胞浆大分子物质和细胞器在膜包囊泡中大量降解的生物学过程。在此过程中，自噬体的形成是关键。在透射电子显微镜下自噬体的直径一般为300～900nm，平均500nm，其双层膜包囊泡内常见的包含物有胞浆成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为：
①大自噬：多数人认为是由内质网来源的单层膜凹陷形成杯状双层膜样的分隔膜，进而完全包绕待降解物形成自噬体，接着与溶酶体融合，自噬体内细胞物质如细胞器被溶酶体酶溶解。
②小自噬：是溶酶体的膜直接包裹如长寿命蛋白并在溶酶体内降解。
③分子伴侣介导的自噬(CMA)：胞浆内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以CMA降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。
自噬的发生过程以大自噬为例可人为的将它分为4个阶段(图1)：
①分隔膜的形成。在饥饿、某些激素等因素刺激下，有双层膜的杯状分隔膜开始在被降解物的周围形成。
②自噬体的形成。随着分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕隔离开形成自噬体。
③自噬体的运输、融合。自噬体形成后将其包裹物运输至溶酶体内与溶酶体融合形成自噬溶酶体，这一过程并非简单的扩散，而是通过细胞骨架微管网络系统的传输实现的。
④自噬体的裂解。自噬体融合后被溶酶体中的水解酶溶解，它先经过囊泡酸化，达到所需pH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。
2真核细胞中自噬的分子调控
2．1自噬体形成的分子机制
根据酵母自噬体的发生过程可分为：
①自噬的诱导：雷帕霉素作用的靶位点(Target ofrapamycin，TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。与bcl-2作用的蛋白beclin-1可以促进缺乏自噬作用的酵母细胞中的自噬作用。此外，GDP结合的C蛋白亚基Gai3是自噬的活化因子，高浓度cAMP也会诱导自噬的发生。
②自噬体的形成：在酵母中发现自噬体的形成依赖于两个泛素样结合系统——Apg12-Apg5和Apg8系统。这种蛋白系统的高度保守性已被实验证明，在人类发现的自噬基因有Beclin1、hApg5、hApg12。
③自噬体的运输、融合：Rho家族涉及细胞骨架，与自噬体的运输有关。自噬体的融合机制与SNARE蛋白Vam3、Vam7、Vti1、Sec19等密切相关。
④自噬体的裂解：在此起重要作用的有Atg15和Atg22。Atg15通过多囊泡小体途径向小囊泡转运，这种蛋白起着脂肪酶相似的作用。Atg22是一种囊泡内膜蛋白，和Atg15相比，其只对自噬体降解起作用。
2．2自噬的信号调控
mTOR途径：酵母中Ser/Thr蛋白激酶Apg1与其它Apg分子结合共定位于自噬前体膜上。饥饿刺激下，Apg13去磷酸化，并与Apg1结合，导致Apg17依赖性自噬的发生。TOR激酶抑制剂雷帕霉素有助于Apg13去磷酸化和Apg1活化，促进自噬发生。磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)：ClassⅠPI3K磷酸化产物通过PKB/Akt调控自噬。也有某些激素在自噬调控中起重要作用，如胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素促进之。此外，酪氨酸激酶受体、PKA、酪蛋白激酶Ⅱ、MAP激酶、钙也存在于自噬错综复杂的调节网络中，但机制不甚清楚。
3自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要：
①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Apg12-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apg12和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上也可见。通过与绿色荧光蛋白(GYP)结合成Apg12-Apg5-GFP、IE3-GFP，即可实现对自噬体的检测。
③单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与MDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。
④间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物——残体的检测。自噬体和溶酶体融合后，除上述的LC3-GFP法检测外，还有吖啶橙染色法。它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。
4自噬与凋亡、坏死
细胞的死亡方式包括程序性细胞死亡和细胞坏死。其中程序性细胞死亡可分为细胞凋亡和自噬型细胞死亡。细胞凋亡的典型细胞核改变：染色质凝集边聚、出现透明区，后来形成半月形核、花瓣状核、空泡状核等。此外，胞浆中还可见许多自噬体、自噬溶酶体和凋亡小体。细胞凋亡依赖于细胞色素C和胱门蛋白酶的作用。自噬型细胞死亡始于细胞的自噬作用，以胞浆中形成大量自噬囊泡为特征，其内存在多种细胞成分(生物大分子和细胞器等)，高尔基体、多聚核糖体、内质网的降解都早于核解体。在此过程中，线粒体功能完整，为自噬提供所需能量，当线粒体绝大部分变性、溶解，染色质断裂、核解体时称之为自噬型细胞死亡。细胞坏死，是由外部的化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，是非溶酶体囊泡进行降解作用的细胞死亡，苏木素-伊红染色后光镜下呈片状无组织结构红染区。
目前，人们更为关注的是对细胞凋亡的研究过程中存在着的细胞自噬以及自噬型细胞死亡。它们之间也存在一些联系，在乳腺癌细胞诱导凋亡中可见到具有凋亡和核固缩形态改变的细胞死亡，都呈现广泛的自噬体形成。从分子水平研究自噬与凋亡关系的新发现是ASP基因的克隆，它的转录产物在正常和凋亡细胞中都有相当水平的表达，编码具有276个氨基酸的蛋白，其基因与自噬基因APG5同源，提示自噬与凋亡之间存在一定的关系。
5自噬的生理、病理功能
5．1自噬的生理功能
5．1．1自噬在细胞代谢中的作用
自噬能清除不正常构型的蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。在饥饿和新生儿早期，自噬作用明显加强，自噬体显著增多。
5．1．2自噬在老化、寿命延长中的作用
随着年龄的增长，氧化自由基对蛋白质等的损坏以及细胞自噬能力的降低，造成异常蛋白质、DNA以及细胞器进行性地积聚，成为体内的生物垃圾。那些积聚的蛋白质分子是老化与许多急、慢性疾病的主要病因，如老化细胞中的脂褐质、阿尔茨海默病等。胰岛素样信号转导途径是线虫dauer发育阶段和寿命的负调控因子，酪氨酸激酶是该途径中的一个关键蛋白质，与此相关的基因是Cebec-1，而它是ATG6(APG6)/VPS30/Beclin 1的同源基因，这提示自噬与寿命延长相关。
5．2自噬的病理功能
5．2．1自噬与病原微生物侵染
吞噬细胞和淋巴细胞可杀死在细胞外的病原菌，当病原菌以内吞形式进入细胞后自噬是细胞主要的防御形式。如A族链球菌内吞小泡进入细胞质后，自噬小泡马上将其包裹，并运送到溶酶体降解。而在自噬缺陷型细胞中，A族链球菌就会存活、繁殖，并从细胞释放出来再感染其他细胞。
5．2．2自噬与神经退行性疾病
自噬参与异常蛋白质的降解，有利于防止神经元内异常蛋白质的蓄积，如帕金森病中的Synuclein蛋白的蓄积与自噬能力下降有关。因而自噬作用过度活跃会造成线粒体功能障碍，如享延顿氏舞蹈病与享延顿蛋白(Htt)的蓄积，Htt激发自噬伴随着细胞凋亡蛋白酶的激活和大量线粒体的受损。
5．2．3自噬与Danon肌病
Danon肌病患者的病理标志是在骨骼肌和心肌细胞胞质中包含有糖原的自噬小泡。实验发现小鼠L4MP-2缺失后自噬小泡不能和溶酶体融合，而产生类似Danon肌病的标志性小泡，由此认为原发Lamp-2缺陷是造成Danon肌病的病因。
5．2．4自噬与肿瘤
人们发现在癌细胞中自噬能力明显低于正常细胞，因而对血清/氨基酸降低或高细胞密度等因素反应迟钝。例如，在转化的纤维细胞中，其蛋白降解速率低于正常细胞，特别是在饥饿条件下更为明显。很显然肿瘤细胞通过改变自噬作用的能力而获得了比正常细胞更强的生存能力，但其内在机制尚不清楚。不过可以肯定的是Beclin 1的过度表达可以抑制乳腺癌的生长正是通过增强自噬来实现的。
6结语
自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程，对防止如神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用。因此对细胞自噬作用和自噬型细胞死亡的研究不仅具有理论意义，而且也具有非常重要的应用价值。自噬基因的发现使我们从分子水平认识了自噬，但对自噬起源、信号转导及其对细胞生存影响的了解尚不全面。随着对自噬作用机制的深入研究，我们期望可以通过调控细胞的自噬水平，控制癌症及神经退行性疾病的发展，延缓衰老，提高生存质量。