孙宇，陈建光
(北华大学药学院，吉林吉林132013)
北华大学学报(自然科学版)
2009年2月第10卷第1期
作者简介：孙宇(1982-)，女，硕士研究生，主要从事心血管药理学研究；
陈建光(1962-)，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事心血管药理学研究。
摘要：
近年来的研究表明，细胞凋亡(apoptosis)与心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusioninjury，MIRI)有着密切关系。全面了解有关研究进展，进一步开展相关的研究，将会为心肌缺血再灌注损伤的防治提供更多的途径。为此，从细胞凋亡的基本知识、心肌缺血再灌注与细胞凋亡的关系、药物干扰作用及研究方法等方面进行了阐述。
近些年来，缺血性心脏病发病率不断上升，而随着各种心血管外科手术如静脉溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary interventions，PCI)等方法的广泛开展，对于恢复心肌灌注、挽救濒死心肌或缩小心肌梗死范围、保护心脏功能起到了很重要的作用，而心脏在缺血和恢复血流灌注后发生的病理生理学改变——缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IR)引起了人们的普遍关注。
随着分子心血管病学研究的不断发展，人们发现缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾病的重要原因。心肌再灌注虽然恢复了血流，但同时也可能加速了受损心肌细胞的凋亡过程。故细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中发挥着重要的作用。
1细胞凋亡
1．1细胞凋亡的概念
细胞凋亡的原词apoptosis是来源于希腊语，其含义为“花瓣或树叶的凋落”。细胞凋亡研究经历了近60年的历史。早在1950年，发育生物学家就通过对蛾变态的观察指出，在脊椎动物正常发育过程中存在着细胞消亡现象，并提出了程序性细胞死亡的概念，认为整个发育程序是受时间和空间条件控制的。20世纪70年代，科学工作者应用光镜和电镜等技术手段观察了哺乳动物体内形态学变化，认识到生理性死亡的形态学特征。直到1972年，澳大利亚的病理学家Kerr等初次从形态学上描述了这种不同于坏死的细胞死亡方式。近年来，随着分子生物学技术的不断发展和对细胞凋亡研究的深入，比较规范地把细胞凋亡定义为：在一定生理或病理条件下遵循自身程序的主动性细胞自杀，是一个积极的、准确调控的、要消耗能量的过程。即有核细胞在一些外部死亡信号的刺激下，通过信号传递途径激活内源性DNA内切酶，启动自身内部的基因表达和调控而引发的连续性程序化细胞死亡(programmed cell death，PCD)，在整个过程中涉及到一系列特殊基因的表达，随之细胞发生特征性的形态学和生化变化。
1．2细胞凋亡的特征
作为细胞的一种由基因控制的主动性死亡过程，细胞凋亡有着其独特的形态学特征和生化特征。
1．2．1形态学特征
在细胞凋亡早期，先表现为细胞核的一系列形态变化，细胞核固缩，核内染色质浓缩并聚集在核膜的内侧呈镰刀状(或新月体形)，与其邻近的核孔消失，此时胞膜结构保持完整，容积皱缩，与邻近细胞失去联系。随后胞膜起皱，表面不平，呈泡状突起，细胞质和细胞器密度增高，细胞体积缩小变得致密，细胞浆空泡变、固缩，但细胞膜的完整性未遭到破坏。至后细胞膜突出、芽生，形成大小不等的膜包裹的凋亡小体(apoptosis bodies)，内含有完整的细胞器和核碎片。凋亡的细胞及碎片可在数小时内很快被附近的吞噬细胞吞噬，不同于细胞坏死的是其并不引起周围组织的炎性反应和继发性损伤，因此，又称为清洁性死亡(clean death)。
1．2．2生化特征
细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中基因组DNA有规律的片段化断裂及蛋白质的不可逆性降解尤为重要。凋亡细胞的内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶的活化，将细胞核染色体在核小体连接处切断，形成180～200bp倍的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上出现特征性“NDA梯状条纹”，因此，称DNA梯(DNA ladder)。目前认为，这是判断细胞发生凋亡的主要标志之一。此外，还有Ⅱ型转谷酰胺酶激活所致的交联蛋白质网形成和胞浆膜修饰。
2心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡
传统的观点认为，心肌细胞和神经元等终末分化的不具备再生能力的细胞不会发生凋亡反应，直到1989年初次证实人类心肌细胞也存有凋亡。1993年Eneler等初次从形态学和生物化学方面证实，缺血再灌注心肌中存有凋亡细胞。此后，越来越多的证据显示，心肌缺血和再灌注损伤引起心肌细胞凋亡。关于心肌细胞凋亡的研究起步较晚，其原因有：凋亡过程短暂且不易发现(持续约1～3h)；方法学限制；低估凋亡在心脏病中的作用。近年来，随着方法学的进步和凋亡研究的深入，已发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡之间有着密切的关系，并且在心脏的生理、病理发展过程中起重要作用，被认为是心脏由代偿性变化向病理性变化发展的细胞学基础。
2．1细胞凋亡在心肌再灌注损伤中存在的依据
多项研究证实，缺血再灌注可诱发心肌细胞凋亡。但是，由于实验动物的种属和年龄、实验模型、心肌缺血及再灌注的时间和程度、凋亡的检测方法存在一定的差异，所以，目前关于凋亡是由心肌缺血性损伤所诱发还是由再灌注损伤所诱发的问题仍然存在着争议。
在MIRI中，研究细胞凋亡先见于1994年Gottlieb等的报道，他们利用家兔离体心脏灌注模型，观察发现单纯缺血30 min，4．5 h和缺血5min再灌注4h的心肌细胞均未出现凋亡现象，而缺血30min后再灌注4h则出现心肌细胞凋亡，形态学上呈现核染色质浓缩，并且有典型的DNA梯状条带现象，提示在缺血再灌注后的心肌中存在DNA的核小体间降解即凋亡，因此，认为凋亡是心肌对缺血再灌注损伤的一个特殊反应。而Fliss等应用在体大鼠心肌缺血再灌注模型，采用原位末端标记法(ISEL)及琼脂糖凝胶电泳技术发现，持续缺血2h或缺血45min后再灌注1h均有典型的凋亡形态改变与特征性DNA梯状条带，并且随着再灌注时间的延长，凋亡细胞的数目增加，且后者的凋亡发生率(23％)显著低于前者(33％)，因此，认为缺血和再灌注大鼠心肌均可发生细胞凋亡。Chakrabarti等在大鼠离体心脏灌注模型上发现心肌缺血10min即出现心肌细胞凋亡，缺血30min达高峰，证实了缺血可引起心肌细胞凋亡。姚震等研究表明，不同时间的心肌缺血再灌注损伤均可导致心肌细胞凋亡，以缺血30～60min后再灌注时明显，说明心肌细胞凋亡的发生率与此前心肌缺血时间长短有关。赵明中等研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡，同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围/心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显著增多。
在人类心肌梗死尸检中也发现梗死灶收缩带有明显的细胞凋亡，该细胞凋亡多分布在短暂缺血后血管再通的相邻部位和梗死灶的收缩带区域，病理学认为，细胞凋亡机制与心肌短暂缺血后再灌注损伤密切相关。Bardales等运用原位凋亡检测方法对因明显心肌梗死者、可疑早期心肌梗死者和没有心肌梗死者的心脏标本中心肌细胞的凋亡情况进行了研究，结果发现所有明确诊断为心肌梗死的心肌细胞均出现凋亡现象，可疑者为97％出现细胞凋亡，而没有心肌梗死者则仅为8％，因此，认为缺血再灌注损伤中有细胞凋亡参与，且再灌注可以加速不可逆转的细胞凋亡，而且心肌细胞的凋亡与缺血再灌注持续时间长短有关。
综上所述，目前认为，缺血再灌注过程中有明确的细胞凋亡参与，细胞凋亡加重了缺血再灌注损伤。长时间持续性缺血和再灌注均可诱发心肌细胞凋亡，尤其是再灌注后细胞内ATP水平迅速恢复，胞浆和线粒体内钙超载，以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性细胞凋亡的发生。
2．2细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用
由于再灌注期间凋亡细胞主要是出现在坏死心肌的周围区域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用。为此，有研究人员采用核酸内切酶抑制剂——金精三羧酸(aurintricarboxylic acid，ATA)分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用。结果显示，在犬冠状动脉梗阻1h再灌注24h模型上，再灌注开始时采用ATA处理可明显减少坏死组织周围区凋亡心肌细胞的数目，同时伴有特征性“DNA梯状条纹”的缺失。这种凋亡程度的降低主要是与Bcl-2上调以及Bax和细胞凋亡蛋白酶(Caspsase-3)活性降低有关。更为重要的发现是，ATA所致的心肌凋亡抑制可明显缩小心肌梗死的面积。因此，抑制细胞凋亡的发生不仅有助于减轻缺血再灌注心肌的坏死性损伤，而且还可改善心脏的机械收缩功能。
上述研究充分说明，细胞凋亡和细胞坏死之间存在着一定的交叉和联系，抑制心肌细胞凋亡的发生可能是临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤的一条重要途径。
3心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生机制
心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中所起的作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不清楚。
细胞凋亡是一个很复杂的过程，其触发机制尚不清楚。细胞增殖剂可促进已进入细胞周期的增殖型细胞增殖，但启动终末分化细胞的凋亡。心肌细胞是非增殖型细胞，已不能进行细胞分裂进入细胞周期，但在一定因素的刺激下仍可跨过G1/S期限制点屏障进入细胞周期，发生分裂增生，并引发细胞凋亡。Kajstura等观察到在急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞发生凋亡时确实存在S期细胞突然增多的现象。
细胞凋亡区别于细胞坏死的一个显著特征即受基因调控，是机体在内外环境刺激下启动的由基因调控的细胞死亡过程。心肌缺血/再灌注损伤过程中，心肌细胞凋亡的发生同样受到细胞周围刺激信号的诱导，并且由特定的凋亡相关基因所控制，细胞凋亡的发生机制目前仍未完全阐明，可能与以下因素有关。
3．1缺血再灌注损伤中细胞凋亡的相关调控基因
尽管对缺血/再灌注损伤中细胞凋亡的调节机制还不甚明确，但资料表明，bcl-2家族、p53、Fas抗原及肿瘤坏死因子(TNF-α)等参与了细胞凋亡的调节。
细胞凋亡的调控基因分为诱导基因(死亡基因)和抑制基因(生存基因)。在生理条件下，心肌细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因(Bax、Fas、p53等)和/或凋亡抑制基因(Bcl-2等)，共同调控细胞代谢而维持细胞内环境的稳定。但在缺血再灌注过程中，凋亡相关基因及其表达产物发生了变化，从而导致心肌细胞凋亡的发生。在调控凋亡的基因中，目前研究较多的是Bcl-2基因家族。
3．1．1 Bcl-2基因的作用
Bcl-2是一种原癌基因，具有促进细胞生存、抗凋亡作用。Bcl-2家族是先被注意到与细胞凋亡有密切关系的基因之一，1984年由Nakmaura等先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的抗细胞凋亡基因，在缺血再灌注损伤中表现得尤为突出。按其功能可分为抗凋亡的Bcl-2亚族(包括Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w，Mcl-1，Nr-13等)和促凋亡的Bax亚族(包括Bax、Bak、Bid、Bad、Bik、Bnips等)，Bcl-2和Bax是其中尤其重要的成员。Bcl-2家族在心肌缺血再灌注损伤所致细胞凋亡中发挥重要的调节作用。
Xie等研究了Bcl-2和Bax在大鼠缺血再灌注损伤心肌的再灌注区和非再灌注区表达的不同，在再灌注区未发现Bcl-2表达，而Bax表达增加，表明该区心肌有发生凋亡的趋势；在非再灌注区Bcl-2表达明显增加，这可能是尚存活的心肌的一种自我保护机制。Zhao等研究了结扎犬冠状动脉左前降支1 h后分别再灌注6、24、48、72h对心肌细胞表达Bcl-2和Bax的影响，结果为随着再灌注时间延长Bcl-2表达逐渐减少，而Bax表达逐渐增多，相应地心肌细胞凋亡指数也随再灌注时间延长而增加。上述结果提示心肌缺血再灌注后局部心肌表达Bcl-2和Box的多少可影响心肌细胞凋亡的严重程度，提高Bcl-2/Bax比率能减少心肌细胞凋亡。
抗细胞凋亡的作用机制有以下几方面：
1)抑制Ca2+的释放。应用转基因方法发现，Bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca2+，故Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与内质网中Ca2+有关。钙泵特异性抑制剂TG诱导的WEH17．2等细胞凋亡可被Bcl-2抑制，其原因是Bcl-2抑制了钙离子的跨膜流动，提示Bcl-2可通过调节细胞内钙离子浓度来调节凋亡。
2)Bcl-2通过阻止促细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用。
3)细胞内抗氧化作用。Bcl-2可通过抑制氧自由基而发挥抗细胞凋亡作用。在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧是触发细胞死亡的主要诱因，Bcl-2的过度表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成。这些发现提示，Bcl-2可能通过抗氧化来抑制细胞凋亡。
同一基因家族的成员何以具有两种截然不同的功能尚有待进一步观察。
3．1．2 P53基因
p53基因是有名的抗癌基因，参与细胞周期调控和DNA修复。p53是细胞生长过程中的分子感受器，监测细胞的DNA状态，起到分子警察的作用。当细胞的DNA损伤时，p53使细胞分裂停止于G1期，即p53表达增加使细胞中止增殖以便使损伤的DNA进行修复取得时间；如果DNA受损严重无法修复，则p53蛋白持续增高，导致细胞凋亡。可见，p53实质上是一种“分子警察”。正常的p53基因可分为野生型和突变型两种，即野生型P53基因(wt-p53)与突变型p53基因(m-p53)均参与细胞凋亡的调节。野生型p53基因能诱导促进细胞的凋亡，突变型p53则抑制细胞凋亡。
近年来，人们发现p53与细胞凋亡有密切关系。齐丽彤等应用Wistar大鼠结扎左冠状动脉45 min再灌注4 h，观察到缺血再灌注过程中心肌细胞P53表达增加。Kirshenbaum等研究心肌细胞凋亡的分子调节机制，结果证实，p53基因为心肌细胞凋亡的激活因子，并且指导促凋亡基因Bax的转录，而且由P53激活的心肌细胞凋亡可以被抗凋亡基因Bcl-2所阻断，支持了Bcl-2是一个强有力的抗凋亡因子。
3．1．3 Fas/Apo-1抗原家族
Fas又称Apo-1或CD95，是位于细胞膜上的一个肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体超家族成员，广泛分布于各种组织细胞中，属Ⅰ型膜蛋白，由胞外区、穿膜区和胞浆区组成，主要通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡。心肌缺血缺氧能引起凋亡促进因子Fas表达升高。
Fas介导的细胞凋亡需要其天然配体FasL参与。Fas诱导凋亡发生的机制有两种解释，一为Fas抗原作为细胞表面受体，与FasL或抗Fas抗体结合，诱导酸性神经鞘磷酸酶的活化，分解神经鞘磷脂，释放神经酞胺，随后神经酞胺可通过膜结合性的苏氨酸或丝氨酸蛋白激酶等激活第二信使途径，导致细胞内钙离子浓度增高，诱导多种生化反应，从而诱导细胞凋亡发生。二为从Fas受体，经Caspsase的调节。活化JNK和p38-k，再通过某种方式激活第二信使途径，使细胞内钙离子浓度升高，进而诱导凋亡的发生。
实验发现，心肌缺血再灌注后梗死周边区发现有大量Fas受体表达，经既是抗氧化剂又是β受体阻滞剂的卡维地洛处理后，梗死周边区凋亡细胞数目减少77％，同时Fas受体表达显著降低，与野生型小鼠相比，缺乏功能性Fas的小鼠离体心脏缺血再灌注损伤明显减轻。以上结果提示，Fas具有促进凋亡发生的作用。赵明中等实验证实，心肌缺血再灌注后Fas基因的RNA及蛋白表达均增多，且随心肌缺血或再灌注时间延长而增加。通过比较研究体外培养的鼠新生心肌细胞和非心肌细胞在缺氧情况下的细胞凋亡，发现缺氧后12h心肌细胞的DNA就发生降解，而非心肌细胞在缺氧72h后仍没有发生类似现象，同时心肌细胞Fas的mRNA表达上调2倍，相反非心肌细胞Fas的mRNA则呈下降趋势，表明缺氧引起的Fas表达增加可能是其引起心肌细胞凋亡的主要机制。进一步研究发现新生大鼠心室肌细胞在缺氧的情况下给予重组的FasL，能明显增加心肌细胞的凋亡，并且伴有Fas死亡结构域相关蛋白等明显增加，而在正常供氧条件下则无上述改变。Fas及Fas-L蛋白阳性表达细胞的分布与心肌凋亡细胞的分布趋势一致进一步显示了它们之间的关系密切，表明Fas、Fas-L系统在缺血再灌注后心肌细胞凋亡中有重要意义。
3．1．4核因子NF-κB的作用
NF-κB是Rel蛋白家族成员，由多肽p50和p65亚基形成p50和p65同源二聚体及p50-p65异源二聚体，其中发挥主要生理功能的是p50-p65异源二聚体。NF-κB多位于细胞的胞浆中，缺血再灌注期间它可被细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-17激活，其中过氧化物对NF-κB的激活更为重要；NF-κB激活后能调节多种细胞因子的表达，如IL-6、IL-8、TNF-α及粘附分子ICAM-1，VCAM-1H和ELAM-1的表达，因而具有重要的作用。
NF-κB与细胞凋亡的关系尚未明确，NF-κB具有抗细胞凋亡作用，它能抑制caspase-8；从其能上调许多有害细胞因子的作用来看，NF-κB能促进细胞凋亡。总之，NF-κB在缺血再灌注损伤中的作用尚未阐明，对缺血再灌注组织的细胞凋亡有何调节作用亦不清楚。
3．1．5半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase家族)
Caspsase是一个特殊的蛋白水解酶家族，全称是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，目前为止已经发现14种。这类蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶类和特异酶切Asp氨基位点两大特点，其与心肌细胞凋亡的关系是近年研究的热点之一。Caspsase家族主要在凋亡的执行阶段起主要作用，凋亡的发生是一系列Caspsase家族成员共同参与完成的，它们的活性部位含半胱氨酸，于底物ASP部位产生特异性水解。在众多Caspsase成员中，Caspsase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的Caspsase家族中的关键蛋白酶。Caspase-3引起DNA损伤修复酶降解，同时激活核酸内切酶，从而使细胞凋亡。Caspsase-3可被该家族其他成员活化，简而言之，多种多样刺激因素启动的信号激活Caspsase-3。活化的Caspsase-3可作用于一些其他Caspsase成员，以瀑布式活化，引起细胞形态上的改变，使凋亡终得以完成。因此，Caspsase-3是凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。正常状态下无活性形式存在于组织中，经凋亡信号刺激活化，导致凋亡细胞解体，能酶解灭活凋亡抑制物，被认为是凋亡过程中关键的通路，但并非是仅有的通路。
有学者研究表明，Caspsase-3对线粒体有正反馈作用，而且对于已经决定走向凋亡的细胞来说，在仅仅依靠Caspsase-3初始激活后对凋亡信号级联反应下游蛋白的水解作用还不能引起细胞凋亡的情况下，必须依靠Caspsase-3对线粒体的反馈作用来放大凋亡信号的力度，破坏更多的线粒体，使其能量和氧化还原电势下降，为线粒体渗透性转运孔道(mitochrondrial permeability transition pore，MPTP)进一步开放和细胞色素C的释放创造条件，使凋亡不可逆转。曾志勇等在猫的体外循环实验中发现，再灌注15 min时心肌Caspsase-3 mRNA的表达量较主动脉阻断前明显增加，再灌注90min时心肌Caspsase-3 mRNA的表达量为主动脉阻断前的4倍，徐强等研究大鼠心肌再灌注不同时相Caspsase-3激活与心功能变化的关系，提出Caspsase-3激活是MIRI后心肌细胞凋亡导致心功能下降的机制之一。据此，对半胱氨酸蛋白酶，尤其是Caspsase-3表达的研究有助于进一步了解MIRI心肌细胞凋亡病理过程的规律，亦为通过抑制细胞凋亡防治MIRI提供了新的位点。
在大鼠和家兔的心肌缺血再灌注模型上应用ZVDA-fmk(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂)后表现为心肌原位缺口末端标记法阳性细胞数减少，心肌梗死面积减少。过度表达心脏特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的转基因小鼠表现为心脏功能减退，心肌梗死面积增加，细胞核、线粒体和肌纤维的超微结构发生改变，但并未观察到凋亡细胞的特征物“凋亡小体”。以上结果提示，凋亡的发生是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应的结果。
Caspsase一旦被激活，便可经过以下3条途径引发细胞凋亡：
1)影响DNA的代谢和修复机制。
2)作用于维持细胞正常形态的蛋白成分。
3)作用于与细胞凋亡有关的基因。
因为该酶在细胞凋亡中起着灭活细胞凋亡的抑制物与促进细胞凋亡的重要作用。
3．1．6 HSP70
HSP70(Hot Shock Protein 70，热休克蛋白70)是一组在外界刺激下维持细胞内稳态的自身保护蛋白，作为真核细胞尤其重要的分子伴侣，在蛋白质折叠、装配、转运和降解过程中起着重要作用。研究表明，转染HSP70的转基因小鼠经历缺血再灌注后，心肌细胞凋亡指数显著降低；对转染HSP70和(或)HSP60的新生大鼠心肌细胞进行缺氧/复氧打击，发现Caspase-3活性降低、胞质中细胞色素C含量减少，心肌细胞凋亡指数减少。
3．2心肌细胞凋亡的外部诱发因素
在心肌缺血再灌注的过程中，炎症细胞、血管内皮细胞和心肌细胞之间发生异常的相互作用，通过释放大量的可溶性炎症介质和介导细胞内钙超载而影响心肌细胞生存的微环境，从而诱发心肌细胞凋亡。
3．2．1中性粒细胞浸润
近20余年的临床与基础研究证明，缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡中大量中性粒细胞聚集，与缺血再灌注心肌的损伤程度密切相关。
在再灌注早期，中性粒细胞与血管内皮细胞、心肌细胞上的粘附因子结合，释放许多具有趋化作用的炎症介质，并可级联放大，促使血管内皮细胞收缩，血管通透性增加，诱导细胞粘附分子(ICAM)以及血管细胞粘附分子(VCAM)广泛表达，促使中性粒细胞粘附、滚动、激活和穿过血管壁游走，通过产生的超氧自由基和蛋白水解酶等多种机制造成血管功能障碍及组织损伤，进而吸引更多的中性粒细胞、血小板，发挥趋化作用，促进中性粒细胞与血管内皮细胞更广泛的粘附，导致“无复流现象”形成。随着再灌注时间的延长，中性粒细胞逐渐迁移进入细胞间隙而直接与心肌细胞发生细胞间相互作用，诱发心肌损伤。在诱发心肌细胞凋亡的过程中，中性粒细胞活化亦同样扮演着尤其重要的角色。
研究显示，在大鼠心肌缺血45min再灌注4h引起的凋亡心肌细胞中，采用髓过氧化酶(MPO)活性来测定中性粒细胞的含量发现，其含量为正常心肌组织的3倍。采用在体大鼠心肌梗死模型的另一项研究同样显示，中性粒细胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌细胞凋亡的程度。在犬和大鼠局部心肌缺血再灌注模型进行的研究发现，危险区中性粒细胞聚集与凋亡细胞数目的增加呈线性关系，提示中性粒细胞与心肌细胞凋亡的发生密切相关。
但是，关于中性粒细胞如何介导心肌细胞凋亡的发生机制目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒细胞聚集堵塞微血管而导致无复流现象，亦可能与中性粒细胞活化后释放大量的炎性介质(例如自由基和细胞因子)有关。因此，对于中性粒细胞在再灌注诱发的心肌细胞凋亡中的直接作用机制，尚需做进一步的研究。
3．2．2氧化应激增强
活性氧(active oxygen)是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应性的其他含氧物质的总称，故又称反应性氧类(reactive oxygen species，ROS)。活性氧包括超氧阴离子自由基(O2-·)、羟自由基(·OH)、单线态氧(1-O2)和过氧化氢(H2O2)等氧自由基。在生理状态下，机体需要不断地产生自由基参与正常代谢过程，多余的自由基可及时地被清除，其产生与清除处于动态平衡。活性氧有很强的氧化活性，可破坏机体氧化/还原动态平衡，造成生物大分子(核酸、蛋白质、脂质)的氧化损伤。凋亡是机体氧化损伤的后果之一。
心肌缺血再灌注时可产生大量的氧自由基。氧自由基(OFR)含量增高明显，生物膜脂质过氧化。蛋白质变性以及合成障碍，线粒体损伤，组织水肿，酶受体和离子通道活性及结构改变，从而造成心肌损伤。在心肌缺血再灌注过程中，心脏可通过下列途径产生大量的氧自由基：
1)中性粒细胞是氧自由基产生的一个重要途径。缺血期间，活化的中性粒细胞可在促炎因子的刺激下聚集到缺血组织，细胞因子转录和表达增加，促使细胞膜脱颗粒，释放蛋白水解酶，炎症浸润线粒体，致使呼吸链电子传递受损，耗氧量增加；随着再灌注期间O2的重新供应，所摄取的氧通过NADPH氧化酶途径产生超氧阴离子，然后在嗜苯胺蓝颗粒释放的髓过氧物酶(MPO)的催化作用下，超氧阴离子可快速异常地产生大量过氧化氢、氢自由基和次氯酸通过上调嘌呤氧化酶和一氧化氮合成酶的活性，内皮细胞和成纤维细胞可合成和释放大量的氧自由基。
研究显示，氧自由基是启动凋亡的重要因子，采用抗氧化剂和自由基清除剂可有效抑制细胞凋亡的发生。Anlborsoi等通过在体犬心肌缺血再灌注模型进行研究发现，重组人超氧化物歧化酶可明显减少心肌缺血再灌注所诱发的TUNEL阳性细胞。Galang等通过研究亦发现，给予SOD和过氧化氢酶可消除缺血再灌注所诱发的心肌细胞凋亡。
前面提到缺血再灌注期间，尤其在再灌注期间组织内氧自由基大量产生，它可能通过以下途径诱导细胞发生凋亡：
1)氧化破坏内质网和线粒体膜的完整性而导致细胞内钙超载，引起脂质过氧化，从而影响信号转导系统，激发有关调控基因，导致细胞凋亡。
2)粒体膜通透性转运孔开放而释放cytoC。
3)直接损伤DNA，激活转录因子AP-1和NF-κB，后者可通过上调TNF-α和白介素-6而诱导心肌细胞凋亡的发生。
4)攻击蛋白质，使许多蛋白质尤其是具有酶活性的蛋白质功能丧失。心肌缺血缺氧可使内源性抗氧化剂如SOD失活或耗尽，导致ATP代谢产物在心肌组织中堆积，产生大量ROS，使细胞内氧化还原状态失衡，诱导某些基因的表达，引起细胞凋亡。
3．2．3细胞内钙超载
近年来，关于Ca2+细胞功能的研究报道很多，游离Ca2+是信号传递途径的成员之一，并认为细胞内钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致心肌细胞死亡的“至后共同通路”，在细胞凋亡中有重要作用。
心肌缺血缺氧期，由于Na+-K+-ATP酶活性降低，使ATP生成减少，影响离子的跨膜转运，导致胞浆及线粒体内Na+超载，后者激活细胞质膜上的Na+-Ca2+交换蛋白，因而在再灌时随着Na+外移，大量Ca2+进入细胞内，形成细胞内Ca2+超载现象。缺血再灌注期间多种因素造成细胞内Ca2+超载，Ca2+作为信号转导系统的第二信使，在细胞凋亡过程中起着重要的作用。
钙超载Ca2+诱导细胞凋亡的调节机制有：
1)细胞内Ca2+浓度升高后可激活内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶，使细胞核内双链DNA在核小体Linker部位降解成寡核苷酸片段。
2)钙超载可直接调节某些Ca2+敏感蛋白酶活性，如核骨架蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、拓扑酶Ⅱ、磷脂酶等。
3)Ca2+可激活蛋白激酶C，激发或促进细胞凋亡，令其转移到细胞膜，使G-蛋白磷酸化，G-蛋白减少，胞内cAMP增加，导致细胞凋亡。
4)Ca2+还可调节谷氨酰胺转移酶的活性，使大量蛋白质发生交联，在脂质膜下形成蛋白质网，防止胞浆内成分外漏，避免了像坏死所致的炎症反应。而且，转谷酰胺酶还参与了胞浆膜的修饰，从而有利于吞噬细胞识别形成的凋亡小体而将其吞噬。
5)线粒体内大量Ca2+聚集，引起线粒体内膜上的通透性转换孔开放，释放细胞色素C入人胞质内，进一步激活Caspsase诱致细胞凋亡。应用Ca2+通道阻断剂硝苯地平能拮抗Ca2+所致的心肌细胞凋亡。
事实上，细胞内钙离子超载及氧自由基的过量产生是同一病理生理过程中的两种不同现象，且两者存在互为因果关系。细胞内产生过量的氧自由基可直接损伤细胞膜，导致细胞膜通透性增加，钙离子内流。而细胞内钙离子浓度增高，又可激活钙离子依赖性蛋白酶，后者可催化黄嘌呤脱氢酶(XDH)转化为黄嘌呤氧化酶(XOD)，而XOD在有氧条件下能促进次黄嘌呤分解为尿酸的同时产生大量的氧自由基。因此，在对缺血再灌注损伤致细胞凋亡的机制认识上不可将两者分开。
3．2．4一氧化氮及一氧化氮合酶
一氧化氮(nitric oxide，NO)是由血管内皮合成并释放的一种内源性舒张因子，是体内一种重要的生物信号分子，在心血管生理学和病理学过程中发挥着重要调节作用。大量的NO具有细胞毒性作用，在体内缺氧状态下，巨噬细胞、中性粒细胞、心肌细胞等均可激活诱生型NO合成酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)产生超剂量的NO，干扰能量代谢、直接损害DNA、激活多聚ADP核糖聚合酶或扰乱细胞内Ca2+稳态，从而引起细胞损伤，导致细胞凋亡。
但NO也是一种细胞保护因子，NO可分别通过cCGMP与cAMP途径降低细胞内Ca2+浓度或阻断Ca2+内流，通过平滑肌细胞舒张等多种途径起到减少心肌再灌注损伤的作用。这些保护作用均由结构型NO合酶(Constitutivenitric oxide synthase，cNOS)完成。所以，NO在心肌缺血再灌注过程中是发挥促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡的作用，可能取决于NO在心脏内发挥作用的浓度和心脏的氧化还原状态。不同的实验方法可能会出现完全不同的实验结果。
3．2．5细胞因子与粘附分子大量表达
细胞因子是体内白细胞及其他不同的细胞分泌的一类小分子水溶性蛋白质，具有多种细胞调节活性。在心肌缺血再灌注损伤中，活化的巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及心肌细胞本身可产生大量的细胞因子和粘附分子。细胞因子不仅可促进心肌炎症，而且还可与粘附分子相互作用而加重心肌细胞凋亡。白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)都参与了心肌缺血再灌注的损伤。
TNF-α是一类具有多种生物学效应的细胞因子，目前有关TNF-α在心肌细胞凋亡诱导中作用的研究较多。在缺血和再灌注期间，心肌细胞内的TNF-α表达明显上调。徐世安等应用大鼠Langendorff离体心脏灌注模型，通过酶联免疫法测定心肌组织TNF含量，原位杂交检测TNFmRNA的表达情况。结果显示缺血再灌注心肌的TNF水平明显升高，并且TNFmRNA也出现表达。
多项研究显示，TNF-α可通过下列机制诱发心肌细胞凋亡：
1)与其受体TNFRI结合后，直接激活心肌细胞凋亡的信号转导通路。
2)激活酸性鞘磷脂酶，通过产生脂质信使神经酰胺而介导细胞凋亡的发生。
3)诱导内皮细胞和部分心肌细胞表达IL-1、IL-2、IL-6、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM1)和血小板活化因子，促进中性粒细胞与内皮细胞的粘附和脱颗粒，并激活NADPH氧化酶而释放氧自由基，从而间接地调控凋亡过程。
4心肌细胞凋亡的研究方法
基于凋亡细胞独特的形态学和生物化学特征，我们可以将凋亡细胞与活细胞和坏死细胞区别开来。心肌细胞凋亡是一个非常复杂的过程，凋亡散在心壁中，并且限制于单个细胞中，整个凋亡过程历时短暂。用凋亡诱导因素处理心肌细胞，细胞很快开始皱缩，并且在几分钟内伴随着细胞表面以出芽方式生成凋亡小体。如果凋亡小体没有被吞噬掉，它们在心肌组织中也只保留几个小时，由于从凋亡开始到凋亡结束的时间相当短，因此，即使是在某种情况下，凋亡的比例相当高，能够观察到的也只是小部分。由于心肌细胞凋亡时程短暂不易观察，再加上方法学的限制，使心肌细胞凋亡的研究相对滞后。目前，对心肌细胞凋亡的研究，主要采用形态学特征检测法、生物化学、免疫化学、组织化学及分子生物学方法来进行定性、定量研究。
4．1形态学特征研究方法
检测细胞凋亡的方法种类很多，形态学是鉴定细胞凋亡尤其可靠的方法，简便而适用。
4．1．1光学显微镜
观察细胞形态特征，如细胞缩小、核质固缩聚集、形成小体及吞噬现象等。但一般只能作细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因为在光镜下某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死)与细胞凋亡的形态相似，难于区别。
4．1．2荧光显微镜
胞膜完整的活细胞对阳离子染料如台盼蓝、碘化丙咤(PI)、溴化乙锭E(B)、氨基放线菌素D(7AAD)等有拒染能力，但坏死细胞(包括凋亡后期的继发性坏死细胞、机械损伤细胞等)可被上述染料标记。细胞凋亡的早期细胞膜虽然尚完整，但可出现细胞膜转运功能一过性的损失，这个阶段凋亡细胞与正常活细胞相比，可对上述几种染料的摄取量增加，但又不如凋亡后期细胞那样明显或深染，此时结合其他方法，可较好地区分早期或晚期的凋亡细胞和正常细胞。
4．1．3电子显微镜
虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体，但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此，用光镜观察难以令人满意，而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡更经典、可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准。
缺点：
1)只能定性，不能定量。
2)标本处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高，不适于大批标本检测。
3)在组织切片上进行电镜观察时，有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别，因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色，可弥补电镜检查的不足。
4．1．4激光共聚焦显微镜
激光共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的新型仪器，它在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。在细胞凋亡研究方面，借助激光共聚焦显微镜可以更清楚地观察到细胞内部的结构，对凋亡细胞固缩染色质和核碎片进行定位，借助荧光标记还可以了解凋亡细胞内部的信号转导，实时检测细胞内环境的各种动态变化。
4．2生物化学特征研究方法
生物化学特征检测法检测细胞凋亡的依据是：在细胞凋亡过程中，染色质DNA在核酸内切酶的作用下，于核小体之间被切断，从而形成以180～200bp为基本单位、长度不一的一系列寡核苷酸片段。
4．2．1琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶电泳法是更早用于研究Apoptosis生物化学变化特征的方法。通过琼脂凝胶电泳的典型DNA梯形谱可检测凋亡。而且这种方法不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化等凋亡信息。目前该方法已经逐渐被新的方法所取代。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法，比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。
细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA后，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。琼脂糖凝胶电泳法常规是以苯酚氯仿对180～200bp的单位或180～200bp倍数的DNA寡聚体进行去组蛋白纯化，将纯化后的双链NDA片段点样于含有溴化乙锭(EB)的1．5％～1．8％琼脂糖凝胶电泳中直接进行电泳分析。在凋亡细胞群中可以观察到典型的呈特征性的“梯状”电泳图谱。
缺点：
1)特异性较差，特征性的180～200bpDNA梯带的出现并非凋亡所仅有，另外，ApoptosisDNA链断裂包括单链和双链的断裂，当单链断裂时不出现典型的DNA梯形谱。
2)不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化等凋亡信息。
3)不能进行准确定量，只能进行半定量。
4)灵敏性较差。
5)适用于只含有单一细胞成分标本的测定，对组织细胞组成复杂者，不能确定凋亡发生于哪类细胞。
4．2．2原位末端标记法(TUNEL法)
原位末端标记法是细胞凋亡时DNA裂解，在内源性核酸内切酶的作用下，在核小体单位间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚，DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TDT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。通常采用的有两种方法：一种是末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法；一种是DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移法(In situ nicktranslation，ISNL)。
TUNEL实验可以在培养细胞、石蜡包埋或冰冻切片上进行，因此，具有较好的定位作用。此法既可定性，又能定量，还可动态观察凋亡细胞超微结构的变化。只要凋亡的细胞DNA中有一定量的断裂点形成，就可以出现阳性反应，因此敏感性较高。但也存在假阳性问题。缺点是实验方法复杂、费时，每次只能处理少量样本。这种方法实质上是分子生物学和形态学相结合的研究方法，已广泛用于心肌细胞凋亡研究中。
4．2．3免疫法
1)ELISA检测法：此法主要是测定核小体。根据细胞凋亡时DNA断裂后产生的各核苷酸小体与核组蛋白H2A、H2B、H3H紧密结合成复合物，基于定量间接酶标免疫鉴定原理，利用抗DNA的单克隆和抗组蛋白抗体进行检测的方法。目前也有开发的检测试剂盒出售。该法敏感性高，不需特殊仪器，不需提取DNA，适合基层工作单位使用，但不能准确测定凋亡细胞的绝对量。
2)活性Caspsase免疫组化检测：Caspsase为ICF/Ced-3家族的统称，直接参与凋亡的早期启动、信号转导及凋亡晚期事件，因而检测激活的Caspase可反映细胞凋亡，用于特异性检测的系列抗体。除免疫组化外，也可用免疫细胞化学、Western blot及ELISA等方法检测Caspsase，测定早期和晚期细胞凋亡。
4．2．4流式细胞仪检测法(flowcytometry，FCM)
细胞凋亡的流式细胞仪检测法是一种可以对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选，是定量检测细胞凋亡的重要方法。用FCM检测凋亡细胞时，必须用荧光染料对细胞进行染色，并要求细胞呈悬浮状态，它能进行细胞DNA和RNA含量分析、细胞周期分析、细胞表面标志分析及细胞受体分析等，但对样品处理要求较高。
基本原理：细胞出现凋亡时，在细胞学上发生一系列特征性改变，如细胞周期停滞、DNA梯度降解、细胞膜通透性增加及细胞DNA和蛋白质含量降低等，通过在代谢、生物化学及分子水平对凋亡细胞单一或多种成分的识别，可以定量检测出凋亡细胞的数量。
5缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的防治
细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的一个重要特征，细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注心肌损伤的严重程度。有效抑制细胞凋亡的发生和发展，是促进缺血再灌注后心功能恢复和减轻心肌致死性损伤的一条重要途径。
目前，在心肌缺血再灌注过程中防治细胞凋亡发生的措施包括：消除诱发细胞凋亡的因素、切断细胞凋亡信号转导途径、提高心肌细胞内源性保护机制和瓦解细胞凋亡信号。由于心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生是多因素和多途径的，所以阻断细胞凋亡级联反应中的关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治细胞凋亡十分有效的方法。
5．1药理干预
Cagli等在缺血前10min用咖啡酸苯乙基酯预处理结扎左前降支鼠的缺血再灌注模型，缺血30min再灌注120min后检测DNA末端转移酶介导的缺口末端标记的阳性心肌细胞，缺血再灌注、缺血再灌注+咖啡酸苯乙基酯、缺血再灌注+谷胱甘肽组分别为60％、30％、40％，并且缺血再灌注+咖啡酸苯乙基酯组具有明显减低一氧化氮的生成，增加超氧化物歧化酶的活性，降低血清肌酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶的水平。Ono等用TAT-四氢生物蝶呤预处理鼠心离体再灌注模型后发现，四氢生物蝶吟组Caspase-3的表达和细胞凋亡数均明显下降，TAT-四氢生物蝶呤通过抗细胞凋亡减轻MIRI，可能成为心脏外科心肌保护的一个新的治疗因素。
5．2缺血预适应
缺血预适应是近年研究热点之一，缺血预处理(ischemicpreconditioning，IPC)具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用。IPC抑制细胞凋亡的机制与激活PKC和减轻缺血期细胞内酸化有关。此外，IPC还可通过减轻炎症细胞与内皮细胞的相互作用抑制Bax在缺血区的表达、减少线粒体CytoC释放和抑制半胧天冬酶的活性而减少细胞凋亡的发生。Nakamura等提出，缺血预适应通过抑制中性白细胞积聚和下调Bax表达而减少心肌细胞凋亡。
5．3热休克预处理
石永忠等报道，热休克预处理增加热休克蛋白的表达，并且阻断线粒体和死亡受体途径，具有明显的抗缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的作用。
5．4基因治疗
利用转基因技术可以从各个环节对缺血再灌注引起的细胞凋亡进行阻断，Hua等转染Ad5dnMyD88到鼠心肌3d后，进行缺血45min再灌注4h，并与对照组相比，发现核因子xB的活性下降50％，Bcl-2水平上升81％，缺血再灌注后的心肌细胞凋亡显著降低59％。Huang等在大鼠缺血再灌注4d前以腺病毒为载体将Bcl-xL基因转入大鼠心脏，发现转入Bcl-xL的大鼠缺血再灌注后心肌细胞凋亡较对照组明显减轻，并减小梗死面积，降低血浆肌酸激酶水平。
5．5中药对心肌缺血再灌注损伤诱发细胞凋亡的抑制作用
国内大量研究表明，中药及提取成分具有良好的抑制心肌细胞凋亡的作用，如丹参、川芎嗪、黄芪、葛根素等。有实验研究，丹参注射液是通过抑制心肌细胞凋亡等作用起到保护心肌缺血再灌注损伤的。李庆林等通过实验发现，金丝桃苷能明显降低缺血再灌注时的细胞凋亡率。黄芪因具有抗自由基、拮抗钙超载、改善内皮功能等多种作用，目前被应用于心肌缺血再灌注损伤并取得显著疗效，但其对再灌注损伤诱发的细胞凋亡的影响在国内未见报道，需进一步实验研究。
6结束语
心肌细胞凋亡是正常心肌组织生长的特征之一。但是，发生在心肌病理状态下的心肌细胞凋亡在心脏功能恶化中起到了重要的作用。心肌细胞的凋亡一方面造成了心肌工作细胞数目的减少，另一方面凋亡后的心肌广泛纤维化有可能导致心肌重塑和恶性心律失常的发生。细胞凋亡是通过多条信号转导通路启动的细胞自杀过程，是维持机体自身稳定的一种重要机制。在心肌缺血再灌注损伤中，细胞凋亡同样具有这一方面的意义。但是，细胞凋亡过度则可加重心肌组织的破坏，因此，细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤过程中具有一定的病理学意义。
综上所述，缺血再灌注组织发生细胞凋亡的机制是一个多因素的过程。细胞凋亡是缺血再灌注损伤的特征性改变，细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注损伤的轻重。现在对心肌缺血再灌注引起细胞凋亡的确切机制尚未阐明，对抗心肌细胞凋亡的治疗也大多处于动物试验阶段，特别是基因治疗离临床应用还有一段距离。抗氧自由基及钙离子拮抗剂的许多试验结果并不一致，以致难以真正的应用于临床实践。这就需要人们更深入地研究启动再灌注期心肌细胞凋亡程序的各种刺激因素及其介导的细胞分子活动，努力寻求阻断细胞凋亡信号或其转导通路的合理方法。随着分子生物学、免疫学等基础医学及临床医学的深入发展，对细胞凋亡、基因调控、信号转导、细胞保护等方面的认识和研究都在逐步提高和深化，对心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡的机制和防治正待取得真正的突破。
凋亡是细胞控制生与死的手段。研究凋亡不仅能够提高对疾病，包括心血管疾病的认识，获得医学上新的治疗方案，而且能够加深对生命本质的理解，具有极其重要的生物学和哲学意义。
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