张震宇刘伟杨卫良毕郑钢

哈尔滨医科大学附属第一医院骨科

摘要：

目的：

研究缺血性损伤和缺血再灌注损伤的发生情况和病理改变，探讨细胞凋亡及相关基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表达规律。

方法：

建立大鼠后肢缺血和缺血再灌注实验模型，光镜下观察缺血和缺血再灌注早期的骨骼肌组织病理学变化，检测缺血和缺血再灌注过程中细胞凋亡现象的发生及相关基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表达。

结果：

缺血5h的大鼠骨骼肌全部存活，而缺血9h者未获存活。缺血和缺血再灌注损伤引起骨骼肌细胞水肿、坏死和细胞凋亡，并于再灌注过程观察到微循环障碍和中性粒细胞趋化浸润现象。缺血7h细胞凋亡率更高，相关基因p53、p21、Bax表达与缺血时间成正比，而Bcl-2表达与缺血时间成反比。

结论：

细胞凋亡是缺血和缺血再灌注损伤的重要病理学改变。

微循环障碍和中性粒细胞趋化浸润是缺血再灌注损伤的重要原因之一。

相关基因表达与凋亡的发生关系密切。

肌肉组织缺血再灌注损伤是近年研究的热点之一，但多集中在心肌等平滑肌的研究，对骨骼肌的研究较少。本研究试图通过对骨骼肌不同缺血时段缺血再灌注损伤后细胞凋亡指数及相关基因表达的监测，探讨骨骼肌缺血再灌注损伤后基因调控的规律及其生物学意义。

材料与方法

一、实验动物和分组

健康Wistar大鼠40只[由哈尔滨医科大学第一附属医院动物饲养中心提供，许可证号：SYXK(黑)2006-023]，体质量250～300s，雌雄不限，清洁级。随机取其中8只为实验对照组，另32只，随机分为4组，每组8只，做缺血再灌注动物实验模型，根据缺血时间3h、5h、7h、9h分别称为3h组、5h组、7h组、9h组，各组再灌注时间均为3h。

二、试剂

细胞凋亡试剂盒、小鼠抗p21、p53，Bax、Bcl-2蛋白抗体、SABC试剂盒均购白武汉博士德公司。

三、大鼠缺血再灌注模型建立方法

根据Gaines等的方法改进，大鼠以体积百分比为0．5％的戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉。于股骨中段水平切断所有股部肌肉至股骨，保留股动静脉、股神经及坐骨神经。实验组于室温(20℃左右)以微血管夹夹闭股动静脉，每1h变换夹闭部位，达到预期缺血时间后，放松微血管夹，形成再灌注，灌注3h，缝合肌肉及皮肤。对照组不夹闭股动静脉，仅离断肌肉，取材后原位缝合肌肉。术后大鼠单独饲养。

四、组织取材方法

实验组大鼠，缺血3、5、7、9h再灌注3h后各时间点分别取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉组织。

对照组离断肌肉组织后当时及其后3、5、7、9h分别取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉组织。

标本采用手术后切除的石蜡包埋组织。4μm连续切片，分别用于HE染色和免疫组化染色。

五、术中术后大体观察指标

缺血模型建立后观察皮肤颜色、肌肉断端渗血、末梢血液循环，以判断是否实现缺血。

缺血再灌注模型建立后，观察皮肤颜色、肌肉断端渗血、末梢血运、动脉搏动、静脉回流和充盈，以判断去除微血管夹后的血运恢复情况。

术后观察后肢的皮肤颜色、末梢血液循环，以判断成活情况。

六、检测方法

取缺血3、5、7、9h再灌注3h后各时间点的骨骼肌组织，检测骨骼肌组织细胞凋亡情况和p53、p21、Bax、Bcl-2的表达。

1．细胞凋亡的检测：

采用武汉博士德公司的细胞凋亡检测试剂盒。应用原位DNA断裂位点的3’-基末端标记法(TUNEL法)，DAB显色，之后用苏木素液轻度复染，脱水，二甲苯透明，封固切片。

2．p53、p21、Bak、Bcl-2的检测：

4μm厚切片，60℃烤片3h，SABC法免疫组化染色技术，之后用苏木素液轻度复染，脱水，二甲苯透明，封固切片。

七、统计学分析

所有数据采用SPSS11．0统计学软件处理，计量资料采用x±s表达，相关基因比较采用配对t检验，凋亡率比较采用X2检验，P＜0．05认为差异有统计学意义。

结果

一、术中、术后的大体观察结果

缺血5h以内的骨骼肌全部成活，末梢痛觉保存较好；缺血7h的8只大鼠中4只后肢渐变为紫黑色，终坏死，4只大鼠后肢存活，但末梢痛觉不良；所有缺血9h的肢体，皮肤终渐变为紫黑色，无存活，解剖股动静脉主干无明显血栓形成。

二、组织学观察结果

再灌注3h内，连续观察HE染色组织玻片，可见明显的缺血再灌注损伤出现。以缺血3h再灌注3h，近60％的肌细胞出现空泡，大量中性粒细胞浸润到血管外，肌膜周边可见浸润的中性粒细胞。缺血3h与5h的肌组织缺血再灌注后病理变化规律相似，损伤明显，而缺血7h和缺血9h的肌组织再灌注后病理变化虽有相似，但程度较弱，肌细胞水肿加重程度较轻，空泡形成数量和中性粒细胞贴壁浸润数量也较少(图1，2)。

三、细胞凋亡及p53、p21、Bax、Bcl-2的表达

正常骨骼肌和缺血3h以内未检测到凋亡细胞，缺血5h再灌注3h，凋亡率显著升高(X2=3．861，P＜0．01)，缺血7h再灌注3h达到高峰，凋亡率随再灌注时间延长而升高，升高幅度较小。凋亡率、p53、p21、Bax的表达，缺血3h组与5h组相比显著升高，差异有统计学意义(q分别为3．873、3．867、3．914、3．933，P＜0．01)；缺血5h组与7h组相比显著升高，差异有统计学意义(q分别为3．923、3．871、3．848、3．972，P＜0．01)。Bcl-2的表达随着时间的延长，明显下降。各时间点凋亡率及p53、p21，Bax、Bcl-2的表达见表1(图3～7)。

讨论

随着分子生物学的发展，细胞凋亡的分子机制得到了一定的阐明，先后发现caspase、Bcl-2、p53等很多基因都与细胞凋亡有着重要关系，同时也发现了多种引导细胞凋亡的信号引导途径。对肌组织缺血再灌注后细胞凋亡的研究多集中在平滑肌上，对骨骼肌研究报道较少。

有研究表明，再灌注早期骨骼肌细胞凋亡率明显升高。骨骼肌的再灌注过程中，从3～9h时都造成了p53和p21 WAF-1的累积增加。许多研究已经证明，活化的多形核白细胞(中性粒)和氧自由基在缺血再灌注过程中的骨骼肌损伤起着重要的作用。再灌注过程中产生的氧自由基能造成DNA损害，激发由p53和p21 WAF-1介导的一系列细胞反应。p53的增长程度与细胞对DNA损害的反应直接相关，可以通过p21WAF-1下游因子的增量调节来影响细胞周期停滞和凋亡。一般情况下，细胞周期停滞是由p21WAF-1的活化来诱导的。从3h到9h，Bcl-2的表达逐渐下降，当p53和p21WAF-1的表达至高时Bcl-2的表达降到至低。线粒体损伤也可能是缺血再灌注诱导细胞凋亡的重要因素。Bcl-2主要分布于线粒体膜上，组成线粒体膜的孔和道，对于维持线粒体的正常功能、控制凋亡因子的外溢有着非常重要的意义。

缺血3～5h，Bax蛋白的水平和细胞的凋亡率有所增加，但增幅较小。虽然再灌注后p53和p21WAF-1的表达率逐渐升高，但缺血3h组的p53表达率高于p2lWAF-1的表达率。这个结果可能说明p53可活化p21 WAF-1，并导致细胞周期停滞，凋亡是由Bax蛋白的活化来诱导的。我们认为，缺血3～5h由p53和P21WAF-1累积来诱导的生长抑制是提供时间以修复损伤的DNA。此时Bcl-2的表达还维持在一个较高的水平。表明Bcl-2蛋白可抑制p53诱导的细胞凋亡。Bcl-2还可通过：

①抑制钙离子的释放；

②抗氧化剂作用；

③保持线粒体膜的稳定性，抑制细胞色素c和凋亡诱导因子的释放。此时Bcl-2/Bax是1．3：1．0。

缺血7h，p53和p21 WAF-1仍在累积，在开始增长时间和高峰时间方面；p21 WAF-1和Bax的变化与p53类似。Bcl-2的表达下降到较低水平，说明p53活化了Bax蛋白。细胞凋亡被诱导产生了，此时凋亡率更高。此时Bcl-2/Bax是0．6：1．0。Bcl-2/Bax的比例是决定细胞生死存亡的变阻器，当细胞接受某些刺激信号后，如果Bcl-2过表达，形成Bcl-2/Bax异二聚体增加，细胞免于凋亡；如果Bax高表达，形成Bax/Bax同二聚体增加，细胞发生凋亡。

本研究中p53与p21 WAF-1各时间点表达接近，说明p21 WAF-1可以以一种非p53诱导的方式活化，p21 WAF-1的活化和细胞凋亡可以同时发生，暗示p21 WAF-1与细胞周期停滞和细胞凋亡都有关。Didenko等指出低水平的DNA损伤产生了一个生长停止信号：p21 WAF-1使之修复损害，高水平的损害触发了细胞凋亡反应，即使在那些已经诱导活化p21WAF-1的细胞里也发生了细胞凋亡。

组织病理学研究显示7h后的损伤远比3h时严重，DNA损害也类似。9hp53、p21 WAF-1和Bax的表达率达到至高；Bcl-2表达率至低，凋亡率无明显增高。这说明7h时，DNA已经损害，而且是不可逆的损害，缺血7h前的药物及手术是有效的，7h后药物和手术可能就无能为力了。对于缺血再灌注损伤更应注重早期诊断和早期治疗。

本研究结果显示大鼠肢体缺血再灌注随着细胞凋亡的增加，p53、p21、Bax的表达明显上升，Bcl-2的表达明显下降，且都在7h时达到至大，说明p53、p21、Bax、Bcl-2的表达变化与细胞凋亡、缺血再灌注损伤密切相关，提示针对这些分子的特异治疗有可能在某种程度上影响缺血再灌注的进程，这种治疗应在缺血7h内进行。而p53、p21、Bax、Bcl-2的检测亦有可能作为早期肢体缺血再灌注的参考指标。