刘晓蓉1，谢有梅2，张成1，王展航1，张为西1，卢锡林1，苏全喜3
收稿日期：2001-09-08；修订日期：2001-12-27
摘要：
目的：
研究mdx鼠体内骨骼肌细胞凋亡情况，探讨凋亡对Duchenne型肌营养不良症(DMD)的发生发展所起的作用。
方法：
采用流式细胞仪碘化丙啶(PI)排斥法测定不同渗透压下成肌细胞的凋亡数目，用TUNEL法测定不同鼠龄的mdx鼠骨骼肌细胞的凋亡情况。
结果：
mdx鼠的成肌细胞在外界渗透压变化的情况下，发生凋亡的细胞数较C57鼠明显增加，且随mdx鼠鼠龄的增长而增加。
结论：
抗肌萎缩蛋白(dys)的缺失引起的凋亡在DMD疾病的启动和病程进展中可能起重要作用。
关键词：mdx鼠；凋亡；抗肌萎缩蛋白
Duchenne型肌营养不良症(DMD)是常见的X连锁隐性遗传病。3～4岁起病，以进行性四肢骨骼肌萎缩无力伴小腿腓肠肌假性肥大为特征，同时累及心肌和呼吸肌，多于未成年死亡，病因是位于Xp21的抗肌萎缩蛋白(dys)基因突变引起细胞骨架蛋白dys缺失。以往人们认为dys的缺失主要引起骨骼肌细胞的变性、坏死及炎症细胞浸润，但近来逐渐发现凋亡在骨骼肌萎缩性疾病中起着重要作用。本文通过对DMD动物模型mdx鼠的骨骼肌凋亡情况的研究，探讨凋亡在DMD发病过程中的作用。
1材料与方法
1．1实验对象及分组
实验共分两组：
对照组：出生3d以内的C57乳鼠15只，4～8周的C57鼠8只；
实验组：出生3d以内的mdx鼠15只，1个月的mdx鼠，3个月的mdx鼠、6个月的mdx鼠各8只。
C57鼠购自中山医科大学实验动物中心，mdx鼠购自美国Jackson实验室。所有动物为二级以上动物，雌雄不限，饲养于清洁级动物实验室。
1．2成肌细胞的培养，鉴定和流式细胞仪检测凋亡
取出生3d以内的C57和mdx乳鼠引颈法处死，去皮后取四肢的骨骼肌各分6瓶进行成肌细胞培养，用差速贴壁法进行纯化，纯化后的细胞以1×105/ml的密度分别接种于75ml的培养瓶里，分别加入高渗透压培养液(普通高糖DMEM培养基中加入等体积的50％的葡萄糖溶液)，正常渗透压培养液(普通高糖DMEM)、低渗透压培养液(普通高糖DMEM培养基中加入等体积的无菌三蒸水)，在5％CO2，37℃的条件下松口培养。7d后胰酶消化，0．4％的台盼蓝染色计数细胞存活比例，用SP免疫组化法进行Desmin染色，DAB显色。另外，用流式细胞仪碘化丙啶(PI)排斥法进行凋亡检测，计算凋亡细胞的比例。
1．3成年鼠骨骼肌细胞凋亡的检测
引颈法处死C57鼠和mdx鼠，取四肢肌肉，OCT包埋，冷冻切片，丙酮固定。采用TUNEL法染色，BCIP/NBT显色，甲基绿复染正常胞核，伊红衬染胞浆。100倍放大倍数下随机选择5个视野进行图像分析，计数凋亡核和正常细胞核数目，按如下公式计算凋亡核占总细胞核数的比例。凋亡核比例＝凋亡细胞核数/(凋亡核+正常细胞核)
1．4试剂与仪器
DMEM培养基(Gibcol)、胎牛血清(杭州四季青公司)、ELITE型流式细胞仪(Beckman Coulter)、冷冻切片机(Leka CM1850型，，SP免疫组化检测试剂盒(福州迈新试剂公司)、细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche)、兔抗鼠desmin抗体(博士德公司)、IBAS 2．5全自动图像分析系统(德国KONTRON)、Ky-F30B 3-CCD彩色图像搔录输入仪(日本JVC)。
1．5统计方法
采用组间t检验。
2结果
2．1成肌细胞培养及鉴定
C57鼠和mdx鼠的成肌细胞培养7d时已铺满培养瓶底，细胞均呈长梭形，体积大小较均一。两组细胞在生长速度和形态上无明显差别。经过胰酶消化、台盼蓝染色后，两组成肌细胞存活率均在99％以上。将细胞涂片进行Desmin染色后可见：为梭形、多核细胞。胞浆被染成棕黄色，胞核不染色或被染成淡黄色，证明此种细胞具有Desmin的形成，是成肌细胞，两组细胞的形态及染色结果无明显差别。
2．2成肌细胞的凋亡
PI排斥法计数1．2×105个细胞中凋亡细胞所占的比例，在正常渗透压下，mdx鼠的成肌细胞凋亡数与C57鼠相差不明显，分别为1．2％和1．1％，且G2期、M期细胞较多，细胞增殖明显，但在低渗的情况下，C57鼠细胞的凋亡效无明显增加(0．6％)，而mdx鼠的成肌细胞凋亡数目增加了一倍(2．5％)；在高渗的情况下，C57鼠的凋亡数目明显增加(8．6％)，但mdx鼠凋亡细胞增加的程度远远超过了C57鼠，达到了10．8％。说明mdx鼠的成肌细胞在细胞外渗透压变化时，凋亡数目明显增加；而G0期、G1期细胞数目变化不明显，G2期、M期细胞减少，细胞增殖减少。
2．3成年鼠的骨骼肌细胞凋亡情况
用TUNEL法险测骨骼肌细胞的凋亡情况，发生凋亡的细胞校被染成蓝紫色，而正常细胞核呈绿色，胞浆呈淡红色，结果显示：C57鼠正常情况下几乎无凋亡细胞，而mdx鼠的骨骼肌细胞的凋亡数目明显高于C57鼠，凋亡细胞核和胞浆固缩、变形，与邻周细胞脱离，凋亡小体形成，且大部分凋亡细胞核主要位于细胞间质。图像分析显示：凋亡随着鼠龄的增长而增加，C57鼠、1个月的mdx鼠、3个月的mdx鼠、6个月的mdx鼠的凋亡细胞核比例分别为2％、5％、25％、42％。各组之间比较差异显著(P<0．05)。
3讨论
本研究中所使用的mdx鼠，是X染色体上dys基因的23号外显子(dys23)发生单个碱基替代，而引起点突变，导致dys缺乏，具有与DMD患者相似的发病分子基础，经过多项研究已证明其具有DMD疾病变化的典型的变性、坏死的病理基础，是一种研究DMD疾病的理想的动物模型，所以，用mdx鼠来研究DMD的凋亡情况是合理的。
目前人们通过对DMD患者的病理研究确认了该病骨骼肌的变性、坏死明显增多，但对坏死是如何启动的知之甚少。同时，人们虽对凋亡本身的启动及发生演变机制有了一定了解，但对于骨骼肌中凋亡的研究却起步晚、认识少，1995年Rodrigues等在电镜下观察到去神经比目鱼肌出现凋亡的形态学改变后，人们才对凋亡在肌病中所起的作用引起重视。1995年Matsuda等初次提供了DMD的肌纤维中存在凋亡的证据，从而引发了人们对DMD中凋亡的研究，本研究结果证明dys的缺乏可以引起肌细胞的凋亡数目增加。
一方面，凋亡肌细胞的增加与细胞渗透压变化有关。在成肌细胞阶段，C57鼠和mdx鼠只有少部分细胞凋亡，可能是维持细胞正常生长和循环的一部分。在细胞外渗透压改变时，mdx鼠的凋亡细胞数较C57鼠明显升高，说明dys的缺乏可引起肌细胞膜通透性增加，使mdx鼠的成肌细胞对外界渗透压变化更加敏感，从而诱导凋亡细胞数目增多。也说明dys的缺乏对成肌细胞阶段的细胞生理就已经产生了一定影响，使细胞在外界环境变化时更加脆弱。另一方面，凋亡随年龄的增长而增加，C57成年鼠的细胞凋亡数目较成肌细胞阶段无明显升高，面对于mdx鼠，凋亡细胞数目随着鼠龄的增加而逐渐增加，且较C57鼠肌细胞的凋亡数目明显增多。这与Sandri等的研究结果一致。
由以上推断，DMD的疾病进展可能与肌细胞凋亡的增加有重要关系：一方面，凋亡的变化过程与DMD疾病的病程相一致，DMD虽是遗传性疾病，但DMD患者在起初的3～4年间发育正常、无症状，而此时骨骼肌细胞的凋亡数目少，凋亡只是维持正常生长代谢的一部分。但是，随著年龄的增长，肌细胞中的凋亡逐渐增加，患者症状出现并逐渐加重，在mdx鼠6个月时(相当于患者的20岁左右)，凋亡细胞数已达40％之多。有研究证明在体外诱发肌细胞凋亡后的8h内，细胞内CPK活性逐渐丧失至不可检测的水平。说明凋亡的启动导致了肌细胞内肌酶的灭活或泄露。CPK、CK-MB在疾病早期、肌坏死出现之前就已出现，很可能是细胞发生凋亡所致。Mikhailov等多人的研究也证明，在运动后，mdx鼠的肌细胞凋亡明显增加，推断DMD患者之所以在3～4岁才出现症状可能与这一时期患者的活动增加、肌肉负荷增加而诱导的凋亡增加有关。所以，凋亡的启动可能是疾病发生的始动环节，是继发引起肌细胞变性、坏死的重要原因，另一方面，肌间质细胞凋亡的增加导致肌细胞再生困难。凋亡细胞主要位于肌间质，而成人或成年鼠的肌细胞再生主要依靠存在于间质的肌卫星细胞，其凋亡使卫星细胞数目减少，病损肌肉的再生和修复受到影响，继发性引起正常肌细胞数目减少，从而使疾病呈进行性发展。
目前对于dys的缺失如何引起凋亡的机制尚不清楚。笔者认为可能有以下几种原因：
(1)Ca2+通道异常：DMD患者肌细胞内Ca2+显著增加，肌膜Ca2+-ATPase活性增加，使细胞钙超载，引起胞内溶酶体酶释放而造成凋亡。钙超载可能是引起凋亡的主要原因。
(2)膜不稳定：dys与dys复合物构成一个跨膜连接体，dys的缺乏可导致细胞骨架的不完整，时各种离子、蛋白的通透性增加，后者导致的细胞内渗透压的变化有可能对凋亡的发生有一定作用，但具体机制尚待阐述。
(3)与炎症相关：炎细胞浸润在DMD肌肉中是常见现象。Spencer等发现：在运动后，mdx鼠的肌肉CTL和辅助T细胞浸润增加，同时炎症相关蛋白Perforin表达浓度升高。在dys基因和perforin基因双敲除的动物模型中，几乎役有凋亡发生，认为：CTL介导的炎症反应对mdx鼠的肌纤维的凋亡和坏死有重要作用，pertorin可能是凋亡的起初启动因素。
(4)NO因素：有人发现dys缺失导致肌肉相关蛋白的表达量异常，其中脑型一氧化氮合酶(nNOS)的表达及在膜上分布明显减少，膜结合NOS活性降低，NO在肌纤维内明显增多，而NO可诱导凋亡的发生。以上均是对mdx鼠和DMD患者肌细胞凋亡的可能解释，其具体发生机制还有待于进一步探讨。
总之，dys的缺乏可引起肌细胞的凋亡数目增加，且凋亡对于DMD的发病和病情进展起着一定的作用，可能是引起DMD发病的始动环节和贯穿病程的重要影响因素。