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《福建医科大学学报》2006年03期

【作者单位】：福建医科大学病理学系

摘要：

目的：

探讨肌营养不良症(DMD)受累肌肉中细胞凋亡的表达及其与病变程度的关系。

方法：

5例无皮肤肌肉病变的外科手术患者(对照组)和30例DMD患者(DMD组)，局部取骨骼肌标本行活组织检查，应用TUNEL原位末端标记法及免疫组织化学法检测细胞凋亡及Caspase3表达情况。

结果：

DMD组TUNEL及Caspase3阳性率分别为76.67%和86.67%，阳性细胞主要分布在坏死或萎缩肌纤维中，对照组呈阴性表达。阳性率与病程长短有关(r=0.437，P<0.05)，与年龄无关(r=-0.273，P>0.05)。凋亡指数与Caspase3表达呈正相关(r＝0.536，P<0.05)。

结论：

人类肌营养不良症骨骼肌细胞凋亡与肌纤维萎缩、坏死有一定关系。

关键词：肌营养不良；肌萎缩；凋亡；Caspase3

进行性肌营养不良症(DMD)是一组骨骼肌呈进行性消耗和肌力减弱的遗传性疾病，直接累及肌纤维，多数患者在20岁以内死亡，另一些患者虽然存活，但逐渐丧失生活能力。肌纤维退变、坏死和再生是DMD共同的病理特征，近年来细胞凋亡与骨骼肌发育及退变之间的关系日益引起重视。有研究显示，在失神经支配及皮肌炎等疾病中，细胞凋亡在肌肉损伤过程中发挥作用，但与DMD的关系尚未阐明。半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Caspase)是一类位点特异性蛋白水解酶，在细胞凋亡的信号转导中起着重要作用，处于信号转导通路的中心位置。其中Caspase3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，也是细胞凋亡的主要效应因子和重要的凋亡执行者，在凋亡的执行阶段，负责全部或部分关键性蛋白酶切，使之激活或灭活，其水解底物多是细胞中的功能蛋白质，分别参与DNA修复、mRNA降解、固醇生物合成和细胞骨架重建等。笔者选取5例正常肌肉及30例DMD采用TUNEL方法及免疫组织化学法进行细胞凋亡的检测及Caspase3表达情况的研究，以探讨肌纤维萎缩、坏死与DMD的关系。

1材料与方法

1.1对象

1990～2003年福建医科大学病理学系确诊为DMD的存档标本30例，男性25例，女性5例，年龄(18.22±13.79)岁(4～50岁)，病程(5.15±4.65)年(1～20年)，其中终末期3例。对照组系无皮肤肌肉病变的外科手术患者5例，男性3例，女性2例，年龄（35.2±19.13)岁(16～57岁），其中4例为骨折患者，1例为食道癌患者。

1.2主要试剂

原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，鼠抗人Caspase3(美国NeoMarkers公司)

1.3方法

所有蜡块重新制成4μm厚切片，常规脱蜡脱水，进行TUNEL及Caspase3染色，阳性对照由试剂盒提供，阴性对照由PBS代替一抗，按说明书操作。

1.4结果判断

1.4.1 TUNEL法检测肌纤维凋亡

选每张阳性切片中凋亡小体数更多的高倍视野10个，计数细胞和凋亡小体数，取10个视野的平均值为凋亡指数(AI)。AI<5%为(-)，≥5%～10％为(+)，11%～15％为(++)，>15%为(+++)。

1.4.2免疫组织化学法检测Caspase3

阳性细胞细胞质染成棕黄色，根据细胞着色深度、范围进行半定量检测，高倍镜下选择10个视野计数，Caspase3阳性细胞数占肌纤维细胞数<10%为(-)，10%～25%为(+)，26%～50%为(++)，>51%为(+++)。

1.5统计学处理

所有数据在SPSS 10.0软件包中进行Fisher准确概率法及相关分析。

2结果

大多数DMD病例中肌纤维大小不一，各肌束均可见轻、中度圆形萎缩肌纤维及肥大纤维散在分布，可见灶性肌溶解坏死、吞噬反应及不透明纤维，间质纤维脂肪组织轻度增生。终末期病例的间质纤维结缔组织、脂肪组织大量增生。对照组正常肌组织TUNEL呈阴性反应，DMD中TUNEL阳性率76.67％(23/30)，差别有统计学意义(P<0.05)。阳性细胞核着色为深棕色，细胞核大小异常，或大于正常2倍以上，或小于1/2，细胞核外形异常，常为扇贝状、波浪状，主要分布在坏死或萎缩肌纤维中(图1)。DMD中7例(-)，其中3例为终末期患者；1例(+)，4例(++)，18例(+++)。Caspase3在正常肌组织中呈阴性表达，细胞质不着色；DMD阳性率86.67％(26/30)，阳性细胞着色为深棕色，主要分布在坏死或萎缩肌纤维中，阳性率与病程长短有关(r=0.437，P<0.05)，而与年龄无关(r=-0.273，P>0.05)。凋亡细胞及Caspase3在DMD中表达呈正相关(r=0.536，P<0.05)。

A：对照组肌组织未见阳性表达；B：DMD肌纤维可见凋亡小体(↑)

图1正常肌组织和DMD肌组织肌纤维凋亡(TUNEL染色×400)

3讨论

细胞凋亡是细胞在基因调控下的主动性死亡，具有独特的形态结构和生物化学特征，与细胞坏死明显不同，其对保证个体正常发育成熟，维持机体正常生理功能和自身稳定，参与肿瘤形成，对于许多疾病的发生有重要的生物学意义。秦瑞峰等在肌细胞的分化、发育过程中观察到凋亡现象的存在，因此认为凋亡的研究对于认识肌肉系统疾病有重要的意义。

DMD是一组骨骼肌呈进行性消耗和肌力减弱的遗传性疾病，直接累及肌纤维，多数患者在20岁以内死亡，另一些患者虽然存活，但逐渐丧失生活能力。目前确认肌纤维退变、坏死和再生是DMD共同的病理特征，但对坏死是如何启动的知之甚少。近年来有研究发现，哺乳动物在胚胎骨骼肌生长的早期阶段40％以上肌细胞通过凋亡方式清除，体外肌细胞培养证实分化成熟的肌细胞存在凋亡，在肌病发展过程中通过调节肌母细胞增殖和分化通道可导致凋亡的发生，表明细胞凋亡与肌病病变发展有一定关系。有研究发现，成年肌营养不良小鼠变化坏死的肌纤维因凋亡所致，推断在人类肌营养不良症肌纤维坏死中凋亡可能起一定作用。

笔者在显微镜下观察到，DMD中受累肌纤维坏死后可见巨噬细胞浸润及吞噬反应，罕见有其他炎症细胞浸润，这与凋亡发生后无炎症反应的形态学改变一致。另外，实验结果显示凋亡细胞主要出现在DMD坏死和萎缩的肌纤维中(占76.67％)，明显高于正常肌组织(P<0.05)，提示人类DMD肌纤维萎缩、坏死与凋亡的关系密切。刘晓蓉等研究表明，凋亡细胞随着mdx鼠龄的增长而增加，推断DMD的疾病进展可能与肌细胞的凋亡的增加有重要关系，而笔者的研究资料显示3例终末期的DMD中未见明显的凋亡小体，可能因为疾病终末期大部分肌纤维已经萎缩消失而被纤维脂肪组织取代，形成的凋亡小体于一定时间后大部分被巨噬细胞或邻近的实质细胞吞噬、降解有关。在非终末期的DMD中，其病程长短与AI值未能发现有一定的相关性，而且由于观察的病例不足以进一步分组，无法进行统计学处理，有待后续研究。

Caspase是细胞凋亡的核心环节，其级联式激活并溶解蛋白质，决定了凋亡形态的变化。Caspase3是一种促凋亡因子，是Caspase系统引起细胞凋亡的下游成分，是细胞凋亡的效应分子。Caspase3通过破坏细胞核纤层，直接导致细胞结构的破坏。有资料表明Caspase3的活化在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中起关键作用，但Tews等的研究结果正相反，在神经源性肌萎缩中未见Caspase3表达。本组资料显示，在DMD中Caspase3阳性率为86.67％，主要分布在坏死和萎缩的纤维中，正常骨骼肌呈阴性表达，进一步证实在DMD中肌纤维的萎缩、坏死等改变与凋亡有关，并且存在着Caspase3的激活；资料还显示Caspase3阳性率与病程长短呈正相关而与年龄无关，提示Caspase3的激活在DMD的肌肉损害中发挥作用。