作者：褚启龙杨克敌王爱国
华中科技大学同济医学院公共卫生学院，武汉，430030
摘要：
大量研究表明，氧化应激可导致细胞凋亡。目前对这一现象有四种解释：ROS活化核转录因子KB并诱导核转录因子-κB表达，导致细胞凋亡；线粒体介导的细胞凋亡；ROS导致DNA损伤，激活P53诱导细胞凋亡及ROS激活SAPK通路介导细胞凋亡。但从总体上看，其分子机制还不十分清楚，有待进一步研究。
机体在有氧代谢过程中产生的活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)主要包括O2-、OH、H2O2、HOCl、NO、O3和单线态氧等，对大多数细胞都具有毒性作用。在正常情况下，机体内ROS的产生和ROS清除系统处于动态平衡状态。由于种种原因，导致ROS产生增多或/和机体清除ROS能力的下降，机体就会出现氧化应激(oxidative stress)。当机体处于氧化应激状态时，体内组织细胞ROS量相对升高，超过机体的清除能力，可导致机体组织脂质过氧化水平升高，引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，对机体造成损害。氧化应激使机体处于易损状态，同时能增强致病因素的毒性作用，可导致基因突变，它不仅与多种疾病的发生发展有关，也与细胞凋亡存在着十分密切的关系。
细胞凋亡(apoptosis)是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)。凋亡细胞具有典型的形态学改变，主要表现为细胞膜出现囊泡、细胞皱缩、核固缩、DNA有序片段化等。细胞凋亡是机体的一种生理机制，在维护机体内环境稳定方面发挥着重要的作用，但细胞凋亡过高或过低都会对机体产生不利的影响。
1氧化应激与细胞凋亡的关系
氧分子作为氧化磷酸化的终末电子受体，在需氧代谢中占有重要地位，但这种对电子需求的同时也导致了各种活性氧的形成，如O2-、OH及具有氢抽提能力的H2O2、HOCl等。ROS可启动一个链式反应，易与细胞膜上的各种不饱和脂肪酸及胆固醇反应，这种直接作用于细胞的氧化损伤能导致细胞凋亡。但生物体在进化的过程中具备有效的抗ROS防御体系，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及抗氧化物质(如维生素C、维生素E)等，因此，机体代谢耗氧的同时常伴有ROS的形成，细胞的功能状态取决于ROS与抗氧化能力的平衡。
1．1外源性活性氧诱导细胞凋亡
1991年，Lennon等发现低浓度的H2O2(10～100μmol/L)可诱导HL-60细胞凋亡，当H2O2浓度继续增高时，便可导致大量的细胞坏死。随后有学者用5μmol/L H2O2作用于胸腺细胞，8h后发现35％的细胞发生凋亡，当H2O2浓度达到100μmol/L时，凋亡细胞达42％。高颖等用300μmol/L H2O2作用于人慢性髓细胞白血病细胞(K652细胞)，发现细胞核固缩、核破裂，FCM-DNA检测在G0/G1峰前存在一低DNA含量“凋亡峰”，DNA电泳显示间隔180～200bp的梯形图谱。近期，Ishisaka等在用H2O2(10～50μmol/L)诱导HL-60细胞凋亡的过程中观察到DNA断裂，并发现线粒体释放CytC和caspase-3被激活；当H2O2浓度达50μmol/L时，溶酶体明显不稳定。Ishisaka根据大量的研究报道及自己的研究成果提出，H2O2是一种细胞凋亡介质。此外，氧化的低密度脂蛋白(OxLDL)能诱导淋巴细胞发生凋亡，脂质过氧化物15-过氧化二十碳四烯酸(15-HPETE)和13-过氧化十二碳二烯酸(13-HPODE)亦可诱导A301细胞发生凋亡。
正常细胞内每天能产生约1×1011个ROS分子，这些ROS主要来源于：
(1)细胞进行有氧代谢时呼吸链产生的副产物，如O2-、H2O2和OH；
(2)呼吸爆发的产物，如O2-、NO、H2O2和Cl-；
(3)脂肪及其他大分子降解时的副产物，如H2O2；
(4)细胞色素P450系统在发挥解毒作用时产生的ROS。
研究发现，当细胞内ROS生成增加或/和抗ROS能力下降时，均可导致内源性ROS增多。有学者报道，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激TNF受体，可导致细胞内ROS水平迅速升高，诱导细胞凋亡，并且这种细胞凋亡能被硫氧还原蛋白或N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制，同时细胞对TNF-α的敏感性与SOD水平的降低明显相关。王爱国等让大鼠自由摄取含150mg/L NaF的水10周后发现，大鼠体内GSH含量下降、ROS和LPO水平升高，肝细胞凋亡率显著增高，肝细胞凋亡与氧化应激之间存在明显的正相关。Murakawa等从鲭鱼体内提取并纯化一种凋亡诱导蛋白(apoptosis-inducing protein，AIP)，用AIP作用于哺乳类细胞后，发现细胞内H2O2水平显著升高，并诱导细胞快速凋亡。MG132(一种26S蛋白小体抑制剂)使HepG2细胞H2O2水平显著性升高和线粒体膜电位下降，导致细胞凋亡，这种HepG2细胞凋亡能被抗氧化剂如NAC、GSH和CAT所阻断；白细胞介素-1(IL-1)可诱导心肌成纤维细胞iNOS表达，使NO含量升高而导致细胞凋亡。Woo等研究发现，As2O3可致人宫颈癌HeLa细胞凋亡，在细胞凋亡早期ROS(主要是H2O2)浓度升高和线粒体膜电位下降，随后出现caspase-3的激活和DNA断裂，同时发现NAC能完全抑制As2O3诱导的细胞凋亡，该细胞与CAT共同孵育也显著性抑制As2O3诱导的细胞凋亡。上述资料充分表明：内源性活性氧生成增多可导致细胞凋亡。
1．3抗氧化应激作用可阻止细胞凋亡
氧化应激使植物表现出与人一样的细胞凋亡，而植物体内的各类抗氧化物质(如醌类、维生素C、维生素E、酶及多肽类等)能保护植物免受氧化应激诱导的凋亡。许多学者也证实抗氧化剂(如NAC、GSH和CAT等)具有抗凋亡作用。不少学者认为抗氧化物质是通过清除ROS的方式起到抗凋亡的作用，但Anuradha等研究发现，抗氧化物NAC和GSH能阻止NaF诱导的HL-60细胞凋亡，并认为NAC和GSH抗凋亡作用是通过维护线粒体跨膜压、阻止线粒体释放CytC和Bcl-2下调实现的。
Bcl-2是原癌基因bcl-2的表达产物，是先被发现的哺乳类细胞凋亡的调控因子，它与死亡基因ced-9编码的Ced-9分子同源，而Ced-9与线粒体呼吸链细胞色素b560复合物Ⅱ相似，说明Ced-9可能具有氧化还原或调节ROS的功能，同时也提示Bcl-2具有调节ROS的作用。细胞内bcl-2表达增强可阻断ROS相关的细胞凋亡，而且Bcl-2能抑制ROS导致的细胞凋亡，但Bcl-2是以什么方式阻断ROS诱导的细胞凋亡目前尚无定论。有报道，在GSH耗竭的神经细胞，Bcl-2不仅可中和H2O2和阻止脂质过氧化物的形成，而且可抑制细胞坏死，据此有人认为Bcl-2通过抑制ROS的形成而阻止细胞凋亡；但另有研究显示，Bcl-2能抑制缺乏ROS的细胞凋亡，综合多方面资料来看，抑制ROS的形成并非Bcl-2抑制细胞凋亡的途径。Steinman认为，Bcl-2本身不是一种抗氧化剂，而是作为一种氧化原对细胞产生氧化应激，诱导细胞内源性抗氧化能力的增强，如SOD、GSH-Px、CAT等酶活性升高，从而阻止细胞凋亡；不过也有人认为，Bcl-2主要是通过维护线粒体膜的跨膜压，阻抑线粒体释放死亡因子如CytC、凋亡诱导因子(a!ooptosis-inducingfactor，AIF)、Pro-caspase-3，6，7等而起到抗凋亡作用的。
2氧化应激诱导细胞凋亡的分子机制
氧化应激诱导细胞凋亡的分子机制目前还不十分清楚，概括起来主要有以下四种认识。
2．1 ROS活化NF-κB并诱导NF-κB表达
核转录因子NF-κB(nuclear factor-KappaB，NF-κB)在正常细胞中与其抑制蛋白(IKB)结合而处于失活状态，许多刺激因素如干扰素(IFN)、脂多糖(LPS)、IL-1、紫外线、病毒等都可诱导IKB磷酸化而使NF-κB活化。NF-κB的激活通常是由氧化刺激引起的，因为ROS可促进蛋白激酶C(PKC)的激活，活化的PKC磷酸化IKB，导致后者与NF-κB解离而使之活化。kotharius等研究发现，氧化应激可活化对其敏感的核因子NF-κB；Angkeow等认为，细胞外的氧化刺激可激活细胞膜上Raci调控的NAD(P)H氧化酶[racl-regulated NAD(P)H oxidase]，后者促使细胞浆中ROS的水平增高，ROS可直接激活NF-κB，也可以通过氧化还原因子-1(redox factor-1，Ref-1)或其他途径间接使NF-κB活化，如通过调节IKB激酶的活性及影响NF-κB与IKB的亲和力的方式来调节NF-κB的活性。Augkeow等在研究中发现一个有趣的现象，Ref-1在细胞浆中抑制Racl诱导的氧化应激和NF-κB的激活，但是它一旦进入细胞核后，可以提高NF-κB与DNA的结合能力，促进基因转录，表现出核内外的双向作用。NF-κB被激活后，转位进入细胞核内，与凋亡相关基因如c-myc等的NF-κB调控元件结合，促进基因转录，诱导细胞凋亡。高颖等用300μmol/LH2O2作用于K652细胞，发现大量细胞凋亡，LCSM(激光共聚焦扫描显微镜)显示凋亡细胞内NF-κB表达增多，提示NF-κB具有促凋亡作用。
2．2线粒体介导的细胞凋亡
线粒体是重要的细胞器，其DNA(mtDNA)是裸露的，并与呼吸链和富含脂质的线粒体膜紧密相连，使其对氧化应激损害的敏感性较核DNA更高；加之催化mtDNA复制的DNA聚合酶不具备校读功能及mtDNA缺乏修复机制等原因，造成mtDNA的损伤积累效应，从而出现片段的丢失、修饰及插入突变，突变的mtDNA可编码结构和/或功能改变的蛋白质(其中一些参与电子传递)，又进一步促进氧自由基的生成，造成恶性循环。Zmmami等的实验结果表明ROS的增加可直接或间接损伤线粒体膜，造成膜电位下降，一些学者的研究结果支持这一结论。而线粒体膜电位的下降可导致膜的通透性增高，使线粒体膜间腔的CytC释放入胞浆，与凋亡激活因子-1(apopotosisactivating factorl，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小体(apoptosome)，在ATP参与下，凋亡小体内的pro-caspase-9可自身激活，形成具有活性的caspase-9，后者进一步激活caspase-3、6、7等；活化的caspase可进一步导致线粒体膜破裂，致使线粒体进一步释放其他一些caspases及激活因子(如AIF、热休克蛋白60/100(Hsp60/100)等)；caspase-3、6、7被激活后，可催化靶底物分裂，如分裂DNA片段化因子45(DNA Fragmentation factor 45，DFF45)释放出具有活性的DFF40，后者进入核内使DNA有序片段化；分裂聚ADP核糖聚合[poly-(ADP-Ribose)polymerase，PARP]和复制因子C大亚基(largesubmfit of replication factor C，RFC140)引起DNA修复和复制障碍，导致细胞凋亡。
2．3 ROS损伤DNA，激活P53诱导细胞凋亡
不少学者认为ROS可直接损伤DNA，因为ROS的中间产物自由基可直接作用于核酸，引起碱基的修饰和DNA链断裂，导致聚ADP核酸转移酶的活化和P53的积累，从而导致细胞凋亡，Schmitt等的研究结果支持这一结论。DNA断裂损伤可以激活DNA依赖性的蛋白激酶(DNA-PK)和ATM(ataxia telangiectasia mutated，突变后患运动失调性毛细血管扩张症的基因表达的蛋白分子，是一种丝、苏氨酸蛋白激酶)，二种酶皆催化c-Abl(一种酪氨酸蛋白激酶)S-465磷酸化激活，后者再结合P53加强其稳定性，这与Martin等的研究结果吻合，许多凋亡因子基因启动子都存在P53反应元件(P53 responsive element，PRE)，结合P53后被激活转录表达，如促使Fas、FasL、Apaf-1、DR-5和Bax等表达增高，而对bcl-2基因则抑制其表达；同时，P53还促进内质网释放TNF-α和Fas，也能与DNA复制蛋白A(replicationprotein A，RPA)结合，阻止DNA复制，上述效应激活caspase-3，6，7，促进细胞凋亡。但P53也促进P21表达而导致G1期阻滞，为什么DNA受损的细胞向凋亡方向而不是向细胞周期阻滞方向发展呢?Seoane等的研究提供了一个合理的解释，转录因子Myc被DNA连接蛋白Miz-1招募到P21启动子上，阻止P53及其他活化因子对P21的激活，从而选择性地抑制了P53对P21的转录活化作用，抑制P21表达，促进细胞凋亡。也有人认为ROS激活P53，诱导FDXP基因(P53家族一个靶基因)表达FR(ferredoxinreductase)，使细胞对ROS介导的细胞凋亡更敏感。
2．4 ROS激活SAPK通路，介导细胞凋亡
丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)信号通路包括三个主要的蛋白磷酸化级联，即细胞外信号转导蛋白激酶(ERKs)、C-Jun N-末端激酶(JNKs)和P38-MAPKs，后两者可被多种应激原激活，故也称应激活化的蛋白激酶(SAPKs)。Ma等研究发现，ROS可激活P38通路；不少学者也证实了ROS可激活JNK。在静止细胞中，JNK与P38定位于细胞浆与细胞核，一旦被激活，细胞浆中JNK与P38转位到细胞核，磷酸化修饰转录因子ATF-2和EIK-1，促进相关基因转录、表达，同时JNK与P38还磷酸化激活MAPK激活蛋白激酶2与3(MAPKAPK2，3），进而对低分子量的热休克蛋白磷酸化，Hsp能易化激活caspase，导致细胞凋亡。Inoshita等研究显示，氧化应激导致JNK活化，后者磷酸化Mcl-1(Bcl-2家族成员之一)丝氨酸121和酪氨酸，使Mcl-1失活，导致细胞抗凋亡能力下降，而转染未磷酸化的Mcl-1后，细胞抗凋亡能力得到增强，表明Mcl-1在抗细胞凋亡中起重要作用。
此外，Carmody等用ROS诱导视网膜细胞后，细胞出现了磷脂酰丝氨酸(PS)外露、DNA片段化、细胞皱缩及细胞膜出现囊泡等典型的凋亡特征；同时用TUNEL法也检测到大量阳性细胞，但在整个细胞凋亡过程中，caspases均没有被激活，使用caspase抑制剂zVAD-fnnk、DEVD-CHO、BD-fmk也没能阻止凋亡的发生，表明视网膜细胞的凋亡过程中存在一条不依赖caspase的途径。Isliisaka等在研究H2O2致HL-60细胞凋亡的过程中也发现，当H2O2浓度在50μmol/L以上时，溶酶体在细胞凋亡过程中发挥一定的作用，认为存在一条溶酶体介导的细胞凋亡途径。氧化应激引起细胞凋亡是当今医学领域的一个研究热点，其分子机制研究才刚刚起步，尚有许多问题需要进一步探讨。