范晓华纪树荣周红俊
《中华物理医学与康复杂志》2007年07期
【作者单位】：山东省立医院康复医学中心；
北京博爱医院；
骨骼肌纤维是多核纤维，肌核的转录活动和/或肌核的数量发生变化时，基因物质的含量可能发生改变，从而参与肌纤维蛋白含量与肌纤维体积的调节。神经肌肉电活动减低和/或负荷的减少(如脊髓损伤、后肢悬吊与太空飞行、制动、失神经支配等)可导致骨骼肌纤维发生显著、快速的萎缩，并伴有细胞核的数量减少。肌核丢失的机制不明，可能与细胞凋亡有关。本文主要归纳肌纤维凋亡与骨骼肌萎缩的研究进展。
细胞凋亡在光镜下不易区分。细胞凋亡分3个阶段，即启始阶段、效应阶段及降解阶段。在启始阶段，细胞内或细胞外损伤与凋亡启动刺激(如氧自由基产物或胞浆内钙离子内流等)活化不同的途径，启动凋亡过程。促凋亡因子bax与抗凋亡因子bcl-2之间的失衡启动线粒体途径。效应阶段又分为线粒体途经、内质网途经与死亡因子及其受体途经。在效应阶段，线粒体膜的通透性增加引起促凋亡因子的释放，如caspase活化因子(细胞色素C、hsp10)以及AIF。这些因子活化caspase水解级联反应，导致降解阶段典型的形态学特征。如细胞骨架的重排、DNA碎片、膜的发泡、凋亡小体的形成。细胞是否发生凋亡是由氧化应激水平决定的。
肌纤维凋亡概述
正常骨骼肌纤维呈细长圆柱形，有多个甚至几百个椭圆形细胞核，细胞核位于细胞周缘。胞浆内含有许多与细胞长轴平行排列的肌原纤维，肌原纤维之间有大量的线粒体、糖原及少量脂滴，肌浆内还含有肌红蛋白。快肌纤维细胞核的数量少于慢肌纤维。
骨骼肌在正常发育过程中，凋亡对肌细胞核的数量起重要的调节作用。包括人类在内的哺乳动物，在胎儿肌纤维发育早期，有40％以上的肌细胞是通过凋亡清除的，说明正常骨骼肌发育中也存在凋亡现象。出生后骨骼肌与成年骨骼肌纤维内，TUNEL阳性细胞核很少见，且没有凋亡相关蛋白(如bcl-2家族或caspase家族)的表达，表明正常骨骼肌纤维的胞浆能够抵抗细胞色素C-依赖的Ⅱ型caspase活化，且缺乏凋亡蛋白激酶活化蛋白-1(apoptosisproteasc activator protein-1，APAF-1)。
同一机体不同细胞谱系有不同的凋亡类型，因此多核肌纤维的凋亡，不同于单核细胞的凋亡。肌纤维内的一个细胞核控制相连的数个肌节，一条肌纤维中，同一时间内并非所有的核均表现为凋亡的DNA碎片，可能为单个肌细胞核的凋亡与相关肌节的降解，长此以往可导致肌纤维萎缩，如失神经支配后骨骼肌失去神经的营养作用、脊髓损伤后骨骼肌神经肌肉电活动与负荷均减少。
病理状态下，肌纤维促凋亡蛋白bax、caspases与抗凋亡蛋白bcl-2的表达均明显上调，说明肌纤维既能启动线粒体途经的凋亡，又能启动抗凋亡作用。Bax与bcl-2表达明显上调，提示线粒体膜内转变小孔的通透性增加是启动肌纤维凋亡的主要原因，bax与bcl-2的失衡可能起着决定性作用。而促凋亡因子FAS的表达、caspases以及其后降解阶段发生的过程与肌纤维凋亡的关系，目前尚不明了。神经肌肉疾病时(如失神经支配、肌营养不良、先天性肌病等)caspase表达上调，慢性心衰或烧伤时骨骼肌caspase表达也上调，尤其是caspase-3可能是参与凋亡肌纤维降解的重要因子。凋亡特定蛋白(apoptosis-pecific protein，ASP)也称为c-Jun/AP-1，是凋亡降解阶段的一个标记物，在肌纤维凋亡的降解阶段表达明显上调，见于有边缘空泡的远端肌病。目前不知ASP的表达仅与凋亡有关，还是与自噬作用形成的边缘空泡有关。
目前尚不清楚降解的肌细胞核与相关收缩成分是如何清除的。Fidzianska等发现，在婴儿型脊髓肌萎缩内，邻近肌纤维吞噬凋亡小体包括降解的染色质与凋亡肌纤维的收缩成分。也有研究发现，凋亡的肌纤维是由巨噬细胞或通过自噬作用清除的，自噬作用与边缘空泡的形成有关。此外，有研究发现，肌节的降解可能早于肌细胞核的降解，蛋白水解作用可能参与肌节的降解。
肌纤维凋亡的机制至今尚不明了，可能与氧化应激产生的氧自由基、一氧化氮、过亚硝酸盐等有关，也可能与细胞浆内Ca2+浓度、TNF-α等因素有关。Leeuwenburgh和Adhihetty等认为，氧自由基的产生可促使线粒体释放细胞色素C，活化caspase-9，进而激活caspase-3，启动肌细胞核的凋亡。细胞浆内Ca2+浓度增高，可激活内质网途径介导的凋亡通路。
肌纤维凋亡与骨骼肌萎缩
一、后肢悬吊引起的肌纤维凋亡
Allen等研究发现，大鼠后肢悬吊后，比目鱼肌(慢肌)肌纤维TUNEL标记的阳性细胞核的数量明显增多，且TUNEL阳性细胞核的出现时间较肌萎缩早，悬吊第7天即可出现。TUNEL阳性细胞核包括形态正常的细胞核，在同一条纤维中也有TUNEL阴性的细胞核。应用激素、IGF-1与训练治疗后，凋亡细胞核数量减少，说明凋亡与肌细胞核丢失有关。Siu等将成年大鼠后肢悬吊14 d后，发现内侧腓肠肌内凋亡DNA碎片较正常对照组明显增加，bax与bcl-2 mRNA的表达上调，胞浆内细胞色素C的浓度增加，凋亡诱导因子AIF的表达也显著上调。说明失负荷引起的骨骼肌萎缩，不仅可导致慢肌肌纤维的凋亡，也可引起快肌肌纤维的凋亡。Alway等研究发现，大鼠后肢悬吊7、14、21 d后，骨骼肌中多聚腺苷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)阳性的细胞核(表示细胞凋亡)分别占22％、12％和10％，caspase水平增高，并伴分化抑制因子-2(Inhibitor ofdifferentiation-2，Id2)表达上调，尤其在悬吊7 d与14 d组。说明Id2可能参与骨骼肌纤维的凋亡，细胞凋亡具有时间依从性关系，肌纤维的凋亡可能是通过启动线粒体途经进行的。此外caspases的表达也上调，使PARP-Ⅰ裂解增多，引起悬吊骨骼肌PARP-1阳性细胞核数量增加，PARP-1可能通过凋亡启始因子激活凋亡程序，失负荷肌内caspase-8表达也上调，因此也可能活化死亡区域受体经由TNF-α途经激活细胞凋亡。
Leeuwenburgh等认为，骨骼肌萎缩与肌核的数量减少有关，而肌核的数量主要是通过凋亡途径丢失的，并认为年龄与骨骼肌萎缩和肌纤维凋亡有关。随年龄增加，比目鱼肌纤维凋亡水平(TUNEL标记的阳性细胞核的数量与DNA碎片)明显增高，caspase-3的活性趋于增加，核酸内切酶G(endonuclease G，Endo G，一种线粒体特异核酸酶)存在核异位现象，但EndoG蛋白含量无改变。这导致肌核领域(即每个核的横截面积)明显减少，其中以老年动物为著。青壮年大鼠失负荷引起的比目鱼肌萎缩与肌核数量丢失有关，而老年大鼠虽然其凋亡水平明显增高，但肌萎缩与肌核数量丢失无关，这种现象有待于进一步研究。后肢悬吊14d后，青壮年组与老年组比目鱼肌的凋亡水平均明显增加，随年龄增长而增加尤为显著；青壮年组caspase-3的活性明显增加，而老年组无明显增加；老年组Endo G存在核异位现象，且EndoG蛋白含量明显增加。表明老年骨骼肌肌核领域存在失调现象，在失负荷后这种现象尤其明显。青壮年与老年骨骼肌纤维凋亡途径不同，失负荷引起的青壮年骨骼肌萎缩是激活caspase相关机制导致肌纤维凋亡，而老年骨骼肌纤维的凋亡可能经由与caspase无关的途径，如EndoG异位。
二、脊髓损伤引起的肌纤维凋亡与骨骼肌萎缩
Dupont-Versteegden等将大鼠T-10水平脊髓横断，并在横断5 d后开始踏车训练5 d，取大鼠比目鱼肌，发现脊髓横断组与训练组活化的肌卫星细胞的数量增加，但训练组增殖的肌卫星细胞并没有融入肌纤维。脊髓横断5d后肌细胞核的数量下降25％，TUNEL阳性细胞核的数量增加，训练后凋亡细胞核的数量较横断组减少，但凋亡细胞核数量的减少并没有导致肌细胞核的数量增加。表明细胞凋亡可能导致脊髓横断后骨骼肌萎缩肌细胞核的丢失；训练能够使肌肉体积增大，但不能增加肌细胞核的数量。此外，他们在大鼠T-10水平脊髓横断后进行胚胎脊髓移植加训练，发现胚胎脊髓移植联合训练能够使比目鱼肌的体积明显增大，肌细胞核的数量较横断组有明显恢复，肌细胞核数量增加可能与肌卫星细胞增殖、分化、融入肌纤维有关。
三、制动引起的肌纤维凋亡与骨骼肌萎缩
Smith等将兔踝关节缩短位管型制动2d与6 d，发现比目鱼肌显著萎缩，肌肉湿重与横截面积下降，电镜观察发现肌纤维核染色质浓缩，肌细胞核形态不规则，肌丝破坏，肌膜下线粒体异常。制动2d，TUNEL阳性细胞核的数量明显增多，制动6 d减少，表明凋亡参与制动引起的慢肌萎缩。Jin等对兔后肢管型制动3、7、14、28 d，发现制动后萎缩骨骼肌内有TUNEL阳性凋亡细胞，说明凋亡参与了制动引起的骨骼肌萎缩的过程。凋亡细胞的数量与制动时间相关，在制动14 d凋亡达高峰，且骨骼肌萎缩的程度与肌细胞凋亡的程度呈正相关。
四、失神经支配引起的肌纤维凋亡与骨骼肌萎缩
失神经支配后骨骼肌萎缩，肌纤维的体积与重量进行性减少。Borisov等研究证实，凋亡参与失神经支配引起的肌萎缩与肌细胞核数量的丢失。从时间依从关系上研究发现，TUNEL阳性细胞核的出现先于骨骼肌的萎缩。Siu等认为，失神经支配后骨骼肌萎缩可通过激活线粒体途经启动肌细胞凋亡。大鼠失神经支配14 d，内侧腓肠肌内TUNEL阳性细胞核的数量明显增多，bax与bcl-2 mRNA表达上调，但bax/bcl-2比例明显增加，细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)、caspase-3、9等的表达也显著上调，表明骨骼肌失神经支配后线粒体途经的凋亡信号因子上调，凋亡在调节失神经支配的骨骼肌萎缩中起着重要作用。临床研究较多的是进行性脊肌萎缩。超微结构下观察发现，肌纤维丢失的机制是凋亡，急性婴儿型脊髓型肌萎缩患儿的肌纤维发生降解现象，TUNEL阳性细胞核的数量增多，伴有凋亡小体的形成以及邻近肌纤维的吞噬作用。凋亡相关因子(如bcl-2、bax、caspase-1等)表达上调。凋亡发生时，同时激活了抗凋亡因子，但抗凋亡因子bcl-2表达上调不足以对抗bax的高表达，因此不能阻止凋亡细胞降解。Tews等对实验性大鼠面肌失神经支配与重支配模型的研究发现，失神经支配骨骼肌凋亡细胞核的数量明显增多，而重新支配的骨骼肌凋亡细胞核的数量明显减少。几乎所有失神经支配的肌纤维都高水平表达bax，其中有25％的肌纤维(主要是萎缩的肌纤维)既表达bcl-2，又表达bcl-xl。神经再支配的肌纤维，凋亡细胞核内bax与bcl-2产物下降表现为时间依赖性。失神经支配肌细胞核凋亡的机制可能也是氧化应激导致肌纤维的变性与丢失。
总之，骨骼肌纤维是多核细胞，神经肌肉电活动减低和/或负荷的减少导致骨骼肌纤维萎缩，肌纤维凋亡可能是骨骼肌萎缩、肌细胞核数量丢失的机制之一。后肢悬吊、脊髓损伤、制动、失神经支配等引起的骨骼肌萎缩均与肌纤维凋亡有关：bax与bcl-2表达上调说明主要通过启动线粒体途经的凋亡引起肌萎缩与肌细胞核数量的减少。肌纤维凋亡的机制可能与氧化应激产生的氧自由基、一氧化氮、过亚硝酸盐等有关。
(修回日期：2007-02-25)
(本文编辑：松明)