郭平凡熊圣仁张金池林春忠陈元美

《中华实验外科杂志》2005年01期

【作者单位】：福建医科大学附属第一医院普外科

摘要：

目的：

探讨白细胞介素-1(IL-1)介导大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的作用及其机制。

方法：

24只健康雄性SD鼠，随机分为：

假手术组：仅行颈外静脉插管术；

损伤组：缺血4 h，再灌注4h；

干预组：缺血4 h，再灌注即刻经静脉导管给与白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra).采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定骨骼肌和肺组织白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA表达；

酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血浆IL-1β水平；

比色法检测血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和组织过氧化物酶(MPO)含量及电镜观察组织超微结构的改变。

结果：

应用IL-1ra后，IL-1βmRNA水平明显降低(骨骼肌：0.73±0.35较1.20±0.42，P＜0.01；肺：1.15±0.23较1.70±0.30，P＜0.01)；

血浆IL-1β水平显著下降(P＜0.01)；

CK(76.77±18.28较127.07±28.34，P＜0.01)、LDH(16 540.85±1 020.63较23 370.61±2 160.54，P＜0.01)、MDA(7.22±1.65较9.73±1.91，P＜0.01)和MPO(骨骼肌：2.24±0.38较4.43±0.65，P＜0.01；肺：1.13±0.16较2.71±0.32，P＜0.01)含量均明显降低，骨骼肌和肺组织超微结构损伤减轻。

结论：

骨骼肌缺血-再灌注激发IL-1的生成，在介导骨骼肌和肺的损伤中起着重要作用。

骨骼肌缺血再灌注损伤(SMIRI)常见于溶栓、Fogarty导管取栓、断肢再植、四肢大血管损伤等疾病恢复血流后。它的发生与过度炎症反应密切相关。IL-1作为一种重要的促炎细胞因子，在炎症反应中起重要的作用。我们以大鼠后肢缺血再灌注为模型，旨在观察IL-1在SMIRI中的作用。

材料与方法

1．动物模型及分组清洁级健康雄性SD大鼠24只(福建医科大学动物实验中心提供)，体重250～300g，随机分为3组，每组8只。参照Crinnion等法建立模型。实验分组：

(1)A组为假手术组，颈外静脉插管，左后肢无张力环绕止血带。

(2)B组为损伤组，缺血4h，再灌注4h，松开止血带时经静脉导管注入0．5ml生理盐水。

(3)C组为干预组，缺血4h，再灌注4h，松开止血带时经静脉导管注入IL-1ra(2mg/kg)。

2．主要试剂：

IL-1ra(北京宝赛生物技术有限公司)，IL-1β酶联免疫吸附试验检测试剂盒(深圳晶美公司)，TrizolRNA抽提试剂盒(Gibcol BRL公司)，逆转录-聚合酶链反应试剂盒(Takara公司)，丙二醛、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。PCR引物由上海博亚公司合成，大鼠IL-1β基因上游引物：5’-GCAGGCTTCGAGATGAACAAC-3’，下游引物：5’-GCCGTCTTTCATCACACAGGA-3’，扩增片段约208bp。大鼠GAPDH内参引物序列：上游引物：5’-CTAAGTGTAGCCCAGGATGC-3’，下游引物：5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，扩增片段约508bp。

3．骨骼肌和肺组织总RNA提取及IL-1βmRNA基因表达：

再灌注4h后取大鼠左后肢骨骼肌(腓肠肌)及肺组织50～100mg分别加入1ml Trizol用玻璃匀浆器充分匀浆，提取总RNA。骨骼肌扩增条件为：94℃变性30s，50℃30s，72℃30s，共30循环，72℃延伸7min。肺组织扩增条件为：94℃变性30s，53℃30s，72℃30s，共30循环，72℃延伸7min。经2％琼脂糖凝胶电泳后用GeL-Proanalyzer凝胶成像仪分析处理。

4．血浆IL-113含量检测：

再灌注0、60、120、240min经颈静脉采血按ELISA方法检测。

5．MDA、CK、LDH、MPO测定：

再灌注4h经颈动脉取血并取骨骼肌及肺组织按常规用比色法检测。

6．电镜检查：

骨骼肌取材后依次经3％戊二醛-1．5多聚甲醛混合液固定，1％锇酸固定，乙醇丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸钙双重染色后，用HU-12A型电镜观察并摄像。

7．统计方法：

数据用均数±标准差(x±s)表示。采用Levene法行方差齐性检验。方差齐，用单因素方差分析，组间及组内用LSD检验：方差不齐，用Games-Howell法进行分析。

结果

1．骨骼肌和肺IL-1β基因表达的变化：

损伤组IL-1β的表达明显增高(P<0．01)，干预组表达降低(P<0．01，表1)。

2．血浆IL-1β的变化：

骨胳肌再灌注后血浆IL-1β水平60min后明显升高，120min达到高峰，干预组IL-1β明显降低(图1)。

3．血浆及组织生化指标测定结果：

损伤组再灌注4h血浆中MDA、CK、LDH与骨骼肌、肺组织中MPO含量均增高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0．01)。应用IL-1ra可使这些指标显著降低(P<0．01，表2，3)。

4．电镜观察结果：

缺血-再灌注后4h，电镜下可见骨骼肌肌丝、肌节排列紊乱，肌原纤维间隙增宽，线粒体肿胀变性，肌丝灶性溶解。肺泡腔内见红细胞、脱落上皮细胞或细胞碎片，局部基膜裸露。肺泡间隔内毛细血管扩张淤血。应用IL-1ra后，上述病理变化明显减轻。

讨论

IL-1β是一种强烈的促炎细胞因子，除调节T细胞和B细胞介导的免疫功能外，还作用于中性粒细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞，在炎症反应和炎症损伤中起着重要作用。以往研究证实IL-1β在缺血再灌注组织中表达升高，本实验结果也显示了相似的结果。过去研究还发现，肠缺血再灌注可致肺组织IL-1βmRNA表达增加，本实验也证明了这一结果。由此表明再灌注激发的炎症反应或炎症损伤可诱使组织自身合成IL-1β，通过自分泌或旁分泌的形式，使组织损伤加重，提示内源性细胞因子IL-1β作为致病递质参与了再灌注后组织损害的发生发展。Ascer等观察表明，骨骼肌缺血再灌注血浆中IL-1β含量显著升高，与本实验损伤组血浆IL-1β含量升高相似，表明IL-1β是缺血再灌注激发的一种早期应激因子，该因子的含量在一定程度反映了炎症反应或炎症损伤的程度。本实验结果显示，IL-1ra能显著降低损伤组血浆中IL-1β含量及幅度，抑制IL-1β在骨骼肌和肺组织中的表达。可见，骨骼肌缺血再灌注早期应用IL-1ra治疗有助减轻IL-1β的过量表达，产生及其介导的炎症反应，从而可抑制SMIRI的发生、发展。

本研究结果显示，损伤组血浆MDA和组织MPO显著增加。MDA含量可反映脂质过氧化程度并间接反映自由基的多少。MPO是中性粒细胞标志酶，通过测定MPO能反应中性粒细胞的浸润程度。同时，血浆中骨骼肌细胞胞浆酶LDH、CK升高，组织超微结构发生明显病理损伤。本实验结果显示，应用IL-1ra能减轻脂质过氧化程度及中性粒细胞的聚集；降低血浆中LDH、CK的含量并减轻组织损伤，证实IL-1β在SMIRI的发病过程中起关键性作用，IL-1ra对SMIRI具有保护作用。