陶丁瞿宁厚王纯
《现代预防医学》2009年21期
【作者单位】：四川省人民医院皮肤外科；成都体育学院运动医学系；
【摘要】：
[目的]
探讨大鼠骨骼肌缺血再灌注后不同时相肌细胞Bax基因蛋白表达的变化。
[方法]
用免疫组织化学方法检测并观察大鼠右后肢止血带缺血再灌注后4h、24h、48hBax基因蛋白在肌细胞中的表达情况；均以同组大鼠左后肢腓肠肌作自身对照。
[结果]
缺血再灌注后4h肌细胞内出现Bax蛋白表达，其阳性表达率为(5.97±1.44)%；
缺血再灌注后24h，肌细胞Bax蛋白表达的阳性率为(18.45±1.81)%；
缺血再灌注后48的肌细胞则未见Bax蛋白的表达；
所有各组左后肢肌细胞内亦无Bax蛋白的表达。
统计分析表明，缺血再灌注后24h组较之4h组、48h组以及实验自身对照组差异有统计学意义(P﹤0.01)。
[结论]
本实验研究表明，缺血再灌注损伤的肌细胞中有促进细胞凋亡基因Bax蛋白的阳性表达，其阳性表达率与缺血再灌注不同时相密切相关，以24h组更为显著，此时病理损害亦更为显著，提示Bax基因促发的细胞凋亡可能是骨骼肌缺血再灌注损伤病理机制中的一个组成部分。
肢体缺血是临床常见的情况，恢复其血液循环是挽救缺血肢体的必须前提，而且血液循恢复得越早越好，这即所谓的再灌注。但是再灌注有时不但不能使缺血肢体恢复正常，反而会加重局部的代谢紊乱、功能障碍、甚至结构损伤，这即是缺血再灌注的局部损伤。再灌注损伤是Jennigs(1960)率先提出的。以后的工作证实，再灌注损伤作为一种普遍的病理生理过程存在于多种组织器官。肢体缺血时间的长短，不仅决定再灌注局部损伤的严重程度和是否能引起全身炎症反应综合征，甚至远隔的多脏器功能障碍，其中肺是易受损的首位靶器官，表现为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，肢体缺血时间的长短还可决定其是否存活。
肢体缺血的再灌注损伤主要是指骨骼肌的再灌注损伤，见于挤压综合征、骨筋膜室综合征、止血带和石膏、小夹板固定的错误使用、断肢再植等。目前更关注对其所致急性肺损伤的作用和机制的探讨，而对再灌注损伤肢体的研究不多。近年发现，细胞凋亡参与了再灌注损伤的病理过程并扮演重要角色。那么在肢体缺血再灌注损伤中，骨骼肌细胞凋亡是否也参与其中?这方面报告很少，而且结论迥异。究竟如何，值得我们进一步研究。
1材料和方法
1．1动物、材料和缺血再灌注损伤模型建立及大鼠分组
1．1．1试验成年大鼠18只(由成都中医药大学动物实验中心提供)，雌雄不限，体重300～350g，常规喂养，活动正常，质量合格。
1．1．2检测所用Bax蛋白即用型试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自美国Santacruz公司，其他试剂均系四川省人民医院病理科提供。
1．1．3缺血再灌注损伤动物模型的建立是按临床骨科膝关节手术时，先行驱血和在大腿上止血带的方法模拟而成。具体方法是用3％戊巴比妥钠对试验鼠进行腹腔麻醉后，将其右后肢先用橡皮带驱血，再用止血带环扎于膝关节以上尽可能高的部位，其张力以恰好阻断血供为度(该肢体苍白，针刺无出血)，应用时间为1．5h。
1．1．4试验大鼠随机分为3组(n=6)，即缺血再灌注后4h组、缺血再灌注后24h组和缺血再灌注后48 h组，以同组大鼠左后肢腓肠肌作自身对照(试验对照组)。
1．2方法
1．2．1病理学检查
将实验大鼠颈部脱臼处死，取腓肠肌常规固定，制片，片厚5μm。切片HE染色，分别观察切片的组织学、病理学表现。
1．2．2免疫组化检测
试验方法和步骤按Bax蛋白即用型试剂盒的说明书进行。
1．2．3凋亡
肌细胞的判定标准上述免疫组化处理之切片，光镜下凡肌细胞浆内有棕黄色着染者为Bax蛋白表达阳性，是为凋亡细胞。每张切片在400倍光学镜下计数500个肌细胞中的阳性细胞，计算其百分率。
1．2．4阳性对照
取对Bax蛋白表达强阳性的大鼠正常结肠组织作上述免疫组化染色，以切片内对Bax蛋白表达阳性的血管内皮细胞为凋亡细胞阳性对照。
1．2．5阴性对照
撤除Bax蛋白单抗，其他同1．2．3。
1．3统计学处理
所得数据以x±s表示，组间比较用t检验，采用SPSS10．0统计软件，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1病理学及免疫组化观察检测结果
2．1．1所有实验大鼠自身对照侧的腓肠肌均显示正常肌组织，肌细胞形态正常，胞浆内横纹清楚，细胞间结合紧密。免疫组化检测未见可判断为Bax蛋白阳性表达的肌细胞。
2．1．2缺血再灌注后4h组腓肠肌有不同程度的充血水肿，切面有血性液体溢出。镜下见肌纤维有程度不一的水肿，局限性肌纤维紊乱，甚至消失，肌间质充血、渗液，小动静脉充盈，可见中性粒细胞贴壁并浸润至肌间隙，偶见坏死崩解的肌细胞液片状外漏。免疫组化检测可发现散在肌细胞浆内有Bax蛋白表达，其阳性表达率为(5．97±1．44)％。
2．1．3缺血再灌注后24h组镜下可见肌间出血，渗液明显增多，大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润，间质血管壁增厚，有血栓形成，肌束内见散在的肌细胞浆内横纹消失，呈斑纹样或空泡样改变，核消失。免疫组化检测，Bax蛋白阳性表达的肌细胞明显增多，但其细胞形态完整核致密或核消失，胞浆内有斑纹样或空泡样改变。Bax蛋白阳性表达的肌细胞占计数肌细胞的(18．45±1．81)％。
2．1．4缺血再灌注后48 h组腓肠肌充血水肿程度有所减轻，切面血性渗出明显减少。镜下见肌间质出血、渗液、中性粒细胞和巨噬细胞浸润及肌纤维水肿均有所减轻，肌细胞间结合较松散，肌细胞核增多。免疫组化检测，未发现有意义的Bax蛋白阳性表达的肌细胞。
2．2数据处理结果
实验对照组缺血再灌注后48h组的大鼠骨骼肌细胞均无有意义的Bax蛋白阳性表达，其阳性表达率视为0；缺血再灌注后4h组肌细胞Bax阳性表达率为(5．97±1．44)％：缺血
再灌注后24 h组肌细胞Bax蛋白阳性表达率为(18．45±1．81)％。后者较之实验对照组、缺血后再灌注后4h和缺血再灌注后48h差异均有统计学意义(P＜0．01)。
3讨论
本文所见的骨骼肌缺血再灌注损伤的光镜下表现与文献报告相符，应该指出，动物下肢以止血带缺血在2～3 h之内，一般不会造成整个缺血肢体不可逆损害。
3．1缺血再灌注损伤发生的机制
如Pack等所强调的，即缺血再灌注损伤发生根本的机制是氧自由基的大量产生和细胞内钙超载以及随之而来的微血管功能障碍。再灌注时，Ca2+大量内流激活了磷脂酶，降解膜磷脂，导致膜损害、脂质过氧化以及破坏细胞骨架并引发中性粒细胞的激活和浸润；通过呼吸暴发释放了大量的氧自由基(这与黄嘌呤氧化酶在再灌注时的活性过度增加有关)，蛋白水解酶及炎症介质引发或加重细胞损伤，氧自由基还有细胞毒作用。在这些因素综合作用下，在微血管内中性粒细胞和内皮细胞相互黏附作用明显增加，其结果是造成微血管功能障碍并灭活一氧化氮(NO)。晚近的研究发现核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(Ap-1)这两个核转录因子及其下游的促炎症细胞因子如TNF-α和IL-6等在心肌缺血再灌注损伤期间的显著表达，提示它们在缺血再灌注损伤发生中的关键作用，这对骨骼肌缺血再灌注损伤的研究具有一定的意义。
3．2关于细胞凋亡
3．2．1细胞死亡形式不止一种，已知的有坏死、凋亡以及有丝分裂细胞死亡(mitoticcell death)，后者又称“有丝分裂灾难”(mitoticcatas-trophe)，是近年发现的，经过有丝分裂的死亡方式，它与细胞分裂过程受阻有关。Majno 1995提出胀亡(oncosis)的概念，现认为这是细胞坏死的早期表现，不是独立的细胞死亡方式。对3种死亡形式的研究，以对细胞凋亡的研究更受重视，并取得令人满意的进展，其研究成果已应用于临床。
细胞凋亡是基因调控的，是为维护机体内稳态的自主性死亡；是为适应内外环境变化，维护正常生长发育、正常生理状况和功能，消除无功能甚至是有害细胞所必须的，这在胚胎发育中尤为重要，因之具有重大的生物学意义。细胞凋亡过程是以胞核DNA片段化裂解为特征，是一耗能的主动过程，有赖于mRNA和蛋白质的新合成。
缺血再灌注损伤时，不足引发坏死但又不可能恢复的肌细胞选择了凋亡。对其要一分为二，负面影响是减少肌组织的实质成分，但也看到其正面作用，即不会像细胞坏死那样产生“次级损伤”，即不会引发周围组织的炎症和免疫反应，这是有利的。
3．2．2缺血再灌注损伤肌细胞凋亡的诱发机制
哺乳动物细胞凋亡途径有二，即线粒体途径(胞内途径)与死亡受体途径(胞外途径)。其中天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶，Caspases)家族在这两条途径中都起着非常主要的作用。缺血再灌注损伤引发的细胞凋亡，与氧自由基的大量产生、钙超载、线粒体通透性转换孔道(MPTP)开放，一氧化氮(NO)的减少和钾通道阻滞有关，更与上面提到的半胱天冬酶的活化直接有关，也与某些细胞因子的产生有关。近期的工作表明，核因子NF-κB是一组调控凋亡的重要转录因子。可见，引发缺血再灌注损伤的机制可能即是导致此时细胞凋亡的机制。
3．2．3缺血再灌注时细胞凋亡的基因调控很复杂，本文仅就凋亡Bcl基因大家族的Bax及bcl-2进行讨论。bcl-2属抗凋亡亚族，这一亚族中还有很多其他成员。bcl-2等对维持线粒体结构和功能的完整性起重要作用，它可增加线粒体内质子的外排，调节线粒体通透性粒转换孔道，阻止C-myc(一种原癌基因)介导的凋亡，抑制与还原型谷胱甘肽含量下降相关的凋亡。bcl-2蛋白分子C端的羧基具有疏水性，含有一个由19个氨基酸伸展形成的跨膜结构，常位于线粒体膜。这一特点与bcl-2调节细胞凋亡的方式和能力非常有关。Bax则属促凋亡亚族(又称原凋亡亚族)的代表，同样这一亚族中还有许多其他成员。它可促使线粒体释放细胞色素C，从而促进细胞凋亡。Bax与bcl-2既可构成异源二聚体，也可自身组成同源二聚体，这取决于bcl-2和Bax之间的比例。异源二聚体占优势时，有利于细胞存活。Bax同源二聚体占优势时，则趋于凋亡。无死亡信号时，促凋亡基因以无活性形式分布于胞液或细胞骨架，抗凋亡基因作为细胞内膜结构的一部分被隔离。此时，两者均无行动，不起作用。在缺血再灌注损伤时，有死亡信号发生，两者均开始行动，一旦Bax的表达占优势即可组成Bax同源二聚体，抑制了bcl-2的抗凋亡作用促进了肌细胞凋亡的发生。本研究表明，缺血再灌注后24h组的肌细胞有显著Bax蛋白高表达，与bcl-2比例发生改变，组成Bax同源二聚体，从而抑制了bcl-2的抗凋亡作用，清除了难以修复的肌细胞。金旭红等认为，制动导致骨骼肌萎缩之所以有明显的细胞发生凋亡，可能是由于废用以及固定引起的相对缺血缺氧所致。这与缺血再灌注损伤所致的肌细胞凋亡有一定的相似之处，因为缺血缺氧可导致线粒体损伤，而线粒体在细胞凋亡调节道路中起着十分重要的作用，前已述及，兹不再赘。在上述可能的诸多因素作用下，复杂的信号转导系统失调，繁杂的凋亡调控基因网络系统失控，从而发生肌细胞凋亡。但是正如bcl-2与Bax之间的关系失衡进而决定细胞是死是活的机制十分复杂，有待深入的研究。
本研究显示，缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡同样可以发生在骨骼肌组织，而且肌细胞凋亡的程度与缺血再灌注不同时相有关，以再灌注后24h更为明显。如何来防治缺血再灌注损伤，已引起国内外的广泛注意，特别应重视缺血预处理的临床应用研究，以挽救更多的缺血肢体。
(致谢：四川省人民医院病理科杨红老师在免疫组化工作中给子大力协助，特此感谢。)
(收稿日期：2008-11-24)