何云凌吴丽颖朱玲玲范明
《生物化学与生物物理进展》2012年03期
【作者单位】：军事医学科学院基础医学研究所认知科学研究室
收稿日期：2011-05-06，接受日期：2011-11-04
【摘要】：
低氧是一种典型的应激环境，细胞在低氧条件下能量和氧化代谢发生改变，其中线粒体产生的大量活性氧严重威胁细胞的存活。线粒体自噬是近年来被发现的细胞适应低氧的一种适应性代谢反应。细胞在低氧条件下能通过上调低氧诱导因子1(HIF-1)，激活BNIP3/BNIP3L及Beclin-1介导的通路诱导线粒体自噬，终减少ROS的产生，促进细胞的存活，使机体产生低氧适应。综述了线粒体自噬在低氧适应中的作用及其机制。
氧在生命体能量代谢和稳态平衡中具有至关重要的作用，它是维持机体正常发育和生长重要的生命要素。机体多种器官或组织处于生理性低氧状态中，并且这种低氧环境影响着机体的生理机能。然而，人们更关注的是病理状态下的低氧对人类健康的威胁，如心、脑缺血/缺氧及高原等特殊低氧环境对机体造成的损伤。因此，研究低氧对机体功能的调节具有重要意义。
线粒体是对低氧反应尤为敏感的细胞器，在低氧下线粒体功能将发生重大调整以适应低氧环境。细胞在低氧应激时受到的至大威胁并不是由于线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)受抑制而导致的ATP生成的减少，而是电子传递链至后的电子受体氧分子供应不足导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量产生。ROS恣意攻击细胞内的脂类、蛋白质、DNA等大分子物质，甚至是细胞器，使它们发生氧化损伤，终威胁细胞的生存。所幸，细胞中存在着一系列调控氧化还原稳态的机制，线粒体自噬便是新近被发现尤为重要的调控途径之一，细胞通过降解受损或老化的线粒体保障细胞内氧化还原的稳态。目前这种适应性代谢机制在低氧应激等领域正受到密切的关注。
1低氧
在正常的生理状态下，机体的器官或组织并非处于20％的氧环境中，而是处于一种相对低氧的环境，这就是生理性低氧。例如，在胚胎发育过程以及成体脑组织中氧均处于较低的浓度，并且这种低氧环境对于胚胎发育和成体脑组织行使正常生理功能是重要的。而另一方面，机体正常的氧供给如果得不到保障会造成一系列的病变，例如高原低氧引起的高原病、心肌缺血造成的心肌损伤、脑中风或脑缺血引起的神经退行性疾病、新生儿围产期缺氧导致的脑瘫等。此外，恶性肿瘤生长过程中，因增殖过快造成局部组织严重缺氧，这也正是肿瘤的重要特征之一。因此，研究低氧导致的机体代谢功能的变化及其发生改变的机制，不仅有助于人们对胚胎发育、成体内神经系统活动等正常生理功能的了解，还有助于人们对缺血缺氧性疾病，以及癌症等多种疾病发病机理的认识，促进对相关疾病的预防和治疗。
2线粒体自噬
2．1细胞自噬与线粒体自噬
自噬(autophagy)是一种通过形成双层膜的自噬体(autophagosome)包裹胞质、细胞器和蛋白质聚合物，并运送至溶酶体进行分解代谢的过程。过去，自噬一直被视为一种死亡程序诱导的细胞死亡。而近些年的研究发现，自噬是对低氧、营养匮乏、病原体感染等外源性刺激的重要适应性反应。它不仅能通过降解形成氨基酸、核苷酸等物质供能量循环，还能作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，保护受损的细胞。通过药物处理等抑制细胞自噬的发生，能促使细胞在外界条件刺激下发生凋亡，则反向证明了细胞自噬的保护性作用。根据降解靶物是否具有特异性，将自噬分为两种类型：即营养匮乏能诱导细胞发生非选择性的自噬，该类型的自噬目的是维持基本的物质能量代谢；另一种是在营养供应充足的条件下发生的靶物特异性的自噬，主要是清除受损的细胞器和代谢产物，防止其对细胞造成进一步的损伤。靶物特异性的自噬包括线粒体自噬(mitophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、核糖体自噬(ribophagy)等，其中线粒体自噬作为细胞内自噬的一种形式，正因为其能在多种病理生理条件下发挥重要的促存活作用而受到人们的关注。
在早期肝细胞糖代谢功能的研究中，人们在电子显微镜下初次观察到哺乳动物细胞中存在溶酶体包裹隔离线粒体的现象。Lemasters等在总结酵母研究中发现这种线粒体特异性的自噬现象，于2005年初次提出“线粒体自噬(mitophagy)”的概念，随后，进一步的研究证实，线粒体损伤能诱导线粒体特异性自噬的发生。在酵母中的研究发现，与自噬相关的Atg32(autophagy related gene 32)基因以自噬受体的形式参与线粒体的自噬降解，但Atg32的表达并不影响其他途径自噬的发生。而在哺乳动物中的研究发现，当线粒体受到损伤并导致膜电位(mitochondrial membrane potential，Δψm)降低时，能通过帕金森病相关蛋白PINK1和Parkin介导的通路诱导线粒体自噬的发生。PINK1是一种线粒体膜蛋白，在正常条件下以线粒体膜电位依赖性的方式被快速降解，线粒体膜电位的降低能稳定PINK1蛋白，使线粒体膜上的PINK1聚集，这样PINK1就能招募具有E3泛素连接酶活性的Parkin从细胞质中转位至功能紊乱的线粒体上，由PINK1招募的Parkin随后将线粒体底物进行泛素化标记，并导致线粒体发生自噬性降解。此外，研究发现，Bcl-2家族中的NIX能通过诱导线粒体膜电位的降低使自噬体特异性地识别和降解线粒体，并且这种NIX依赖性的线粒体自噬对于红细胞成熟过程中线粒体的清除是重要的。上述的研究结果证实，线粒体自噬不仅是一种具有选择性的自噬过程，它还在疾病防御和机体发育中发挥着重要的作用。
2．2凋亡与线粒体自噬
自噬与细胞死亡存在密切的联系。一方面，在应对低氧等多种应激环境时，自噬能通过降解错误折叠的蛋白质和损伤的细胞器防止细胞触发凋亡途径，发挥重要的细胞保护作用。另一方面，在长期或剧烈的外界环境刺激下，持久的自噬则会直接导致细胞的死亡。
线粒体是细胞中氧化还原平衡以及能量代谢的重要场所，也是细胞凋亡的主要调节部位，因此在细胞生存和死亡中扮演着重要角色。通过氧化磷酸化产生ATP是线粒体尤为重要的功能之一，线粒体通过氧化磷酸化产生ATP的同时，还伴随产生O2、H2O2等多种ROS。应激条件下，线粒体外膜如果因受ROS攻击而破裂会使线粒体向胞质内释放细胞色素c、凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)等凋亡相关蛋白，从而诱导细胞进入凋亡途径．但是，线粒体自噬可以作为一种防御机制能清除损伤的线粒体和过量产生的ROS，确保细胞内线粒体功能稳定，促进应激环境中细胞的存活。反之，如果线粒体自噬的防御功能得不到充分发挥，过量产生的ROS将诱导细胞进入凋亡等途径，导致细胞死亡。
3低氧通过HIF-1、ROS调控线粒体自噬
低氧广泛存在于多种病理生理环境中，对细胞中线粒体的功能影响尤其大。氧浓度的降低会抑制线粒体的氧化磷酸化功能，导致线粒体产生更多的ROS，致使氧化还原代谢紊乱。线粒体自噬能通过减少ROS的产生平衡这一代谢紊乱。那么，在低氧条件下线粒体自噬如何被激活?其调控途径有哪些?阐明这些问题将有助于人们对机体自我调节的低氧适应有更深入的理解。
3．1 HIF-1
低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是机体维持氧稳态信号系统中关键的异二聚体转录因子，由一个受氧调节的。亚基和一个组成型表达的β亚基组成。常氧条件下，脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)会将HIF-1α402和564位点上的脯氨酸残基羟基化，从而使HIF-1α被肿瘤抑制蛋白VHL(vonHippel-Lindau)识别进入泛素化-蛋白酶体途径降解。另一方面，HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1，FIH-1)能将HIF-1α803位点上的天冬酰胺残基羟基化，阻止HIF-1α与转录共激活因子CBP/p300的结合，从而抑制HIF-1的转录活性。低氧条件下，PHDs由于缺乏底物O2使羟基化受阻，HIF-1α得以稳定表达。此外，当FIH-1活性受到低氧抑制时，可以解除对HIF-1转录活性的影响。HIF-1α入核后与β亚基形成HIF-1异二聚体，HIF-1靶向性地与低氧反应元件(hypoxia responsiveelement，HRE)结合，并调控下游基因的表达。受到HIF-1调控的下游基因多达数百种，它们参与调节线粒体及糖代谢、血管及红细胞生成、胚胎发育、细胞死亡及增殖分化、炎症和肿瘤生长等多种病理生理过程。
3．2 ROS与HIF-1
线粒体是氧化磷酸化的场所，是细胞的主要供能单位，同时也是细胞消耗氧的主要细胞器。线粒体功能的正常行使依赖于氧的正常供应。在低氧条件下，线粒体电子传递链因为没有充足的氧分子充当电子的受体而发生紊乱，电子传递链通过复合体Ⅰ(NAOH脱氢酶)，复合体Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)和复合体Ⅲ(细胞色素c还原酶)产生大量的ROS。ROS中H2O2的增多能通过激活Rac或Rho等小GTP酶(smallGTPases)介导的信号通路抑制PHDs的催化活性，从而稳定HIF-1α。稳定表达的HIF-1先能激活丙酮酸脱氢酶(PDH)激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，Pdk1)基因的表达，PDK1通过磷酸化作用使PDH的催化亚基失活，从而阻碍丙酮酸转化为乙酰辅酶A进入线粒体的三羧酸循环，这样就减少了由电子传递链产生的ROS。另一方面，HIF-1能通过激活下游基因的表达改变电子传递链复合体的结构，进而抑制ROS的产生(图1)。研究证明，低氧条件下，HIF-1通过激活细胞色素c氧化酶由COX4-1向COX4-2转变，这种转变抑制了电子传递链中ROS的产生。此外，近期的研究还显示，HIF-1能够调节低氧条件下细胞miRNA-210的表达，而miRNA-210能抑制电子传递链复合体Ⅰ中必需组分铁硫簇组装蛋白ISCU1/2的表达，因此通过影响复合体Ⅰ的正常表达，从而调节ROS的产生。
当细胞遭受剧烈或长期的低氧刺激时，会产生大量的ROS打破上述几种维持氧化还原稳态的机制，从而对线粒体造成伤害。研究发现，在细胞中还存在着一种由HIF-1介导的线粒体自噬途径，能够通过改变代谢方式来适应这种低氧刺激，促进细胞存活。
3．3 HIF-1调控线粒体自噬的作用途径
在HIF-1下游的诸多靶基因中，有一类能编码调节细胞死亡的蛋白质．BNIP3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3)和BNIP3L(BNIP3-like)是两种受HIF-1直接调控的细胞死亡相关蛋白，它们均为Bcl-2家族中只含BH3结构域(The Bcl-2 homology domain 3-Only，BH3-only)亚家族中的成员。BNIP3是BH3-only家族中的一员，也是一种HIF-1依赖性的基因，其启动子中含有HRE，并且在适度低氧条件下能被诱导表达。BNIP3L也被称为NIX，是一种BNIP3类似物，与BNIP3拥有56％的序列同源性，它同样也是BH3-only家族中的一员并能被低氧诱导表达。过去，BNIP3和BNIP3L被普遍认为是促凋亡蛋白，在肿瘤细胞遭受低氧时被诱导表达并与细胞死亡密切相关。然而，近期的一些研究发现，BNIP3和BNIP3L在促进细胞存活的自噬过程中发挥着重要作用。2008年，Zhang等证明了低氧能通过BNIP3依赖的方式诱导线粒体自噬。另外，在大鼠心脏组织的研究也发现，HIF-1依赖性的BNIP3表达对于线粒体自噬是重要的。与BNIP3相似，Sandoval等在红细胞的实验中证明，BNIP3L能引发线粒体自噬并且在红细胞分化过程中很重要。Bellot等在多种正常细胞和癌细胞中均证实，当细胞经受低氧(1％O2)或者严重缺氧(0．1％O2)处理时，能通过HIF-1介导的BNIP3和BNIP3L表达促使线粒体自噬的发生，从而防止细胞死亡，甚至在经过一周低氧处理后这种现象仍然能被观察到。
BNIP3和BNIP3L是低氧诱导激活线粒体自噬发生中的重要信号分子，它们是通过怎样的机制激活线粒体自噬呢?Beclin-1在BNIP3/BNIP3L介导的线粒体自噬通路中起重要作用(图1)。Beclin-1是酵母中自噬相关基因Atg6在哺乳动物中的同源物，被认为在激活自噬前体结构中具有重要作用，调控自噬体的形成。Beclin-1也是一种只具有BH3结构域的蛋白质，因此Beclin-1能通过BH3结构域与Bcl-2或者Bcl-XL相结合，而BNIP3和BNIP3L也均是因为具有BH3结构域，方可与Beclin-1竞争性地和Bcl-2或者Bcl-XL结合。当BNIP3和BNIP3L表达升高时，Beclin-被从Bcl-2/Beclin-1或Bcl-XL/Beclin-1复合物中释放出来，游离的Beclin-1能与多种蛋白质共同形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)复合体，该复合体能通过PI3K/Akt途径调节下游多种自噬相关的Atg蛋白在自噬前体结构中的定位，从而激活线粒体自噬的发生。Zhang等在小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast，MEFs)上利用短发夹结构RNA特异性地阻断Beclin-1的表达，能抑制HIF-1依赖的BNIP3途径介导的促细胞存活作用，而用siRNA靶向性抑制Atg5能产生与抑制Beclin-1表达相同的结果。Beclin-1是激活自噬的上游信号分子，而Atg5是线粒体自噬执行过程中的关键蛋白，因此Atg5在低氧条件下对于Beclin-1激活的自噬发生起重要介导作用。
研究证实，Beclin-1还参与缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，IR)引起的线粒体自噬的发生。IR中由于氧化应激的产生而对组织器官造成损伤。为了减少这种损伤，机体会通过激活自噬或者凋亡来维持内环境的氧化还原稳态。当IR对心肌细胞造成损伤后，心肌细胞中的自噬过程也受到相应的影响，通过过表达Beclin-1能增强自噬过程，对细胞产生保护效应。IR诱导并激活线粒体自噬的现象不仅在心肌细胞中被观察到，而且在肾细胞和肝细胞中也观察到同样的现象。研究发现，IR能诱导肾脏中Beclin-1的表达，引起自噬的发生，而过表达Bcl-XL能降低这种诱导效应。在肝脏中通过诱导Beclin-1等自噬相关蛋白的表达能产生类似于IR的作用。上述的这些研究结果暗示了缺血/再灌注过程中，通过线粒体自噬清除受到ROS损伤的线粒体，这在细胞减缓低氧损伤和促进存活中起着重要的作用。
Beclin-1介导的自噬途径在低氧诱导的线粒体自噬中起着关键的作用，但它并不是BNIP3和BNIP3L调节自噬的仅有通路。有一种理论认为，BNIP3和BNIP3L能直接引发线粒体膜的去极化，而线粒体的去极化足以导致线粒体发生自噬。另有研究报道，BNIP3L能与自噬发生所必需的Atg8家族中的成员相互作用，特别是γ-氨基丁酸受体相关蛋白(GABA-receptor-associatedprotein，GABARAP)和LC3(microtubule-associated protein1 light chain 3，MAP 1 LC3)。LC3是哺乳动物中存在的酵母自噬相关基因Atg8的同源物，也是一种泛素类蛋白，在线粒体自噬中起重要作用，同时也是一种自噬体标志物。BNIP3L与已经证实的Atg8相互作用因子p62相似，都含有LC3相互作用区并能与GABARAP和LC3相互作用。研究发现，表达并定位于线粒体外膜上的BNIP3L与自噬体标志物GABARAP和LC3的结合介导自噬体靶向性清除损伤的线粒体。
3．4 ROS调控线粒体自噬的作用途径
线粒体中ROS的大量产生导致氧化失衡是诱导适应性线粒体自噬的主要原因。ROS造成的氧化应激不仅能通过HIF-1介导的信号途径诱导线粒体自噬的发生，还能通过激活其他多种信号分子控制的途径对细胞自噬进行调节(图1)。
研究发现，外源H2O2处理能导致氧化应激和线粒体损伤的产生，并激活自噬。在氧化应激条件下，碱性亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor2)能诱导p62蛋白的表达，p62反过来又能激活NRF2，进行反馈调节。p62也被称为SQSTM1(sequestosome 1)，它能将氧化损伤或者未折叠的蛋白质运送至自噬途径降解。p62还能与LC3相互作用，在连接自噬体和损伤线粒体中起靶向调节作用。此外，ROS还能通过另一种低氧诱导因子HIF-2α(hypoxiainducible factor-2)调控自噬。在小鼠中的研究发现HIF-2α能调节超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase 2，SOD2)的活性并减少ROS含量。研究还发现低氧诱导上调的HIF-2α能通过激活转录因子FOXO3(forkhead boxO3)调节BNIP3的表达。长期低氧时，转录因子PERK(PKR-like ERkinase)能被激活，并诱导其下游LC3和Atg5的转录，进而调控自噬。ROS还能通过多种其他途径诱导细胞中非线粒体途径的自噬，降解细胞中受损伤的大分子物质以及细胞器，达到促进细胞存活的作用。
4小结及展望
线粒体自噬作为一种选择性的细胞自噬途径，与细胞的其他自噬相似，在细胞生存中发挥重要作用。特别是当细胞受到以低氧应激为代表的外环境刺激时，线粒体自噬能通过特异性降解受损的线粒体来防止进一步的损伤，保护细胞存活。同样在多种病理生理条件下，线粒体自噬能通过降解细胞内受到损伤的线粒体和清除过量产生的ROS来防止细胞进入死亡途径。因此，细胞通过线粒体自噬这一主动调节过程能增强机体在低氧等环境下的适应能力，也有可能成为相关疾病的预防与治疗的潜在靶点。